口服二乙基亚硝胺诱导建立同系小鼠肝硬化模型

谭嘉鑫，游 逾，曾林立，赖洁娟，张玉君，别 平，白莲花

（第三军医大学西南医院肝胆外科，重庆400030）

口服二乙基亚硝胺诱导建立同系小鼠肝硬化模型

谭嘉鑫，游 逾，曾林立，赖洁娟，张玉君，别 平，白莲花

（第三军医大学西南医院肝胆外科，重庆400030）

目的 尝试采用二乙基亚硝胺（DEN）喂饲小鼠成功诱导和建立小鼠肝硬化模型。方法 选取纯系C57BL/6小鼠60只，随机分为实验组和对照组，各30只。实验组小鼠喂饲含DEN的饮水诱发肝硬化，对照组小鼠喂饲蒸馏水。采用HE染色、Masson染色等方法观察两组小鼠肝脏组织形态、纤维化，并连续30 d监测两组小鼠体质量变化，用行为学方法观察两组小鼠的自主运动差异判断其精神状态变化。结果 随着喂饲DEN时间的增加，HE染色和Masson染色均显示实验组小鼠肝脏纤维化组织增生，肝硬化程度逐渐加重，各时间点的半定量评分系统评分与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。实验组小鼠的体质量随着DEN喂饲时间的增加而明显降低，而对照组小鼠的体质量却略有增加，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组小鼠的运动总路程少于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 DEN喂饲可诱发C57BL/6小鼠逐渐从肝纤维化到肝硬化，最终成功建立了前所未有的可作为研究人类肝硬化的一种理想动物模型。

二乙基亚硝胺； 肝硬化/病理学； 小鼠； 模型； 诱导

肝硬化是临床常见慢性进行性肝病，常由肝纤维化演变而来，最终发展为肝癌，严重危害人类健康。初期增生的肝脏纤维组织形成小的条索，尚未互相连接形成纤维间隔而改建肝小叶结构时，为肝纤维化。其实质是细胞外基质（ECM）的合成率大于降解率，在肝脏内过度沉积的病理学改变，加重之后发展为肝硬化。随着研究不断深入，学者对肝硬化的发病机制有了更加深入的认识，并提出肝纤维化甚至肝硬化可能逆转的观点[1-2]。因此，建立肝硬化动物模型是肝硬化研究的必要条件。目前，研究肝硬化的同系动物模型缺乏。本研究采用喂饲二乙基亚硝胺（DEN）建立小鼠肝硬化模型，旨在探讨该方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 纯系C57BL/6小鼠60只，雌性和雄性各30只；8～10周龄；体质量为20～22 g。均购自第三军医大学大坪医院动物实验中心，购回后无特定病原体级适应性喂养2 d。DEN购自美国sigma公司。

1.2 方法 将60只小鼠随机分为实验组和对照组，各30只。将0.14 mL DEN溶于1 000 mL灭菌水（浓度为133 μg/mL），配成 DEN溶液。实验组小鼠连续喂饲6d DEN溶液，然后喂饲1 d蒸馏水，如此循环。对照组小鼠仅喂饲蒸馏水。分别于饲喂第4、6、8、10、12周脱颈处死实验组和对照组小鼠，每组每次6只，采集肝脏标本。取肝左叶，迅速置于10%甲醛溶液固定3 d，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片。行HE染色与Masson染色检测。采用Chevallier等[3]的半定量评分系统（SSS）对小鼠肝纤维化程度进行评分。造模第1～30天，每天定时测量小鼠体质量。造模第8周时，在实验组和对照组中各随机选取6只小鼠进行旷场实验，利用旷场设备观察记录分析小鼠的自发性活动、应激及探索习性。实验开始前2 d，将小鼠置入行为实验室适应整体环境。正式实验时，将小鼠置于大小为25 cm×25 cm×32 cm的插板式实验场中，任其自由活动10 min，严格避免声音和光线刺激。旷场设备摄像头追踪记录小鼠运动轨迹，利用其软件分析小鼠运动总路程。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组小鼠肝组织病理学检查情况 在第11周时实验组死亡1例小鼠。对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，肝窦正常，未见异常肝细胞及纤维组织增生。实验组小鼠第4周肝小叶结构较清晰，少量纤维组织增生；第6周肝小叶结构较完整，纤维组织轻度增生；第8周肝小叶中央静脉增厚，纤维组织明显增生；第10、12周肝脏大量纤维组织增生，假小叶出现，肝硬化形成。见图1、2。

图1 两组小鼠肝组织病理学检查结果（HE染色，200×）

2.2 两组小鼠SSS分数比较 实验组小鼠第4、6、8、10、12周SSS分数分别为（1.17±0.41）、（3.83±1.47）、（12.16± 1.72）、（18.50±1.87）、（22.33±0.81）分；对照组小鼠分别为（0.40±0.17）、（0.40±0.17）、（0.51±0.33）、（0.51±0.33）分、（0.51±0.33）分。两组小鼠第4、6、8、10、12周SSS分数比较，差异均有统计学意义（t=4.254、5.688、16.316、23.212、62.549，P＜0.05）。

图2 两组小鼠肝组织病理学检查结果（Masson染色，200×）

2.3 两组小鼠体质量变化情况比较 对照组小鼠第1～30天体质量随喂饲时间延长逐渐增加，实验组小鼠体质量逐渐下降，两组体质量变化呈线性趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 两组小鼠第1～30天体质量变化

2.4 两组小鼠旷场实验情况比较 对照组小鼠运动总路程为（20 140±2 156）mm，显著多于实验组小鼠的（16 384±2 738）mm，两组比较，差异有统计学意义（t= 2.64，P＜0.05）。

3 讨 论

肝细胞受损后，会引起肝细胞的坏死、再生、发生局灶性肝纤维化，进而发生肝硬化[4]。在中国，乙型肝炎病毒感染为肝硬化的主要起因[5-6]。肝脏损伤持续存在，组织发生修复反应时因细胞外基质合成速度大于降解速度，引起纤维结缔组织增生，称为肝纤维化，当其进一步发展引起肝小叶改建，有假小叶及结节形成时则称为肝硬化，最后演变为肝癌[7-8]。肝硬化为肝癌的前置病变。为早期防治肝硬化提供理想的动物模型具有重要意义。

目前，制备肝硬化模型的方法较多，应用较为广泛的动物模型有化学性肝硬化、营养性硬化、酒精性肝硬化、免疫性肝硬化、胆总管结扎致肝硬化、血吸虫性肝硬化等。每种造模方法致病因素不同，诱导肝硬化的机制、稳定性、重复性也不同。文献中对小鼠诱发性肝硬化模型报道较少，虽有报道用四氯化碳（CC14）和乙醇能诱发小鼠肝硬化[9-10]，但成功率不高，却在诱发过程中小鼠死亡率很高；也有报道用CC14腹腔注射的方法诱导小鼠肝硬化[11]。有报道称，单纯应用DEN在12～15周能成功诱发大鼠肝硬化[12-13]，但此方法未见在小鼠中报道。因此，本实验应用DEN对C57BL/6同系小鼠进行肝硬化诱发，得到了理想的小鼠肝硬化模型。

DEN具有较强的肝脏化学毒性，其所含的亚硝胺基团具有中毒剂和诱癌剂的双重作用[14]，DEN诱发的肿瘤多为肝细胞癌，与人类肝细胞癌较为相似[15]。Sato等[16]研究表明，DEN是一种很强的化学致癌剂，且对肝脏有明显的亲和性。本实验在用DEN诱导建模后，从形态学等方面进行了模型的验证，经Masson三色染色证实实验组小鼠肝组织中央静脉及汇管区周围胶原纤维随时间变化明显增生。在后期肝细胞索排列紊乱，肝细胞空泡样变性，小叶间隔形成。

综上所述，本实验成功采用单剂量DEN短时期喂饲的方法建立同系小鼠肝硬化模型，具有死亡率低（小于10%）、操作方便、费用低廉、诱导周期短、重复性好、肝硬化率较高等特点，与人类肝硬化发病特点相似，拓展了小鼠肝硬化模型的构建方式，是一种成功的小鼠肝硬化模型。

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Oral DEN induction in establishment of liver cirrhosis in homologous mice

Tan Jiaxin，You Yu，Zeng Linli，Lai Jiejuan，Zhang Yujun，Bie Ping，Bai Lianhua
（Department of Hepatobiliary Surgery，Southwest Hospital of Third Millitary Medical University，Chongqing 400030，China）

ObjectiveTo attempt oral DEN to induce and establish hepatic cirrhosis model in C57BL/6 mice.MethodsA total of 60 C57BL/6 mice were randomly divided into the experimental group and the control group，30 of each group.The mice in the experimental group were fed with water contaning DEN while the control group with distilled water.The liver morphological structure and fibrillation of the two groups were observed by HE and Masson dyeing.The body weight variation of mice in the two groups was measured in consecutive 30 days.The difference in autokinetic movement between the two groups was investigated by behavioral approach to judge their mental state changes.ResultsIt showed with the longer DEN was given，the heavier the fibrosis tissue hyperplasia and hepatic cirrhosis degree displayed by HE and Masson dyeing.The semi-quantitative scoring system scoring at different time points in the experimental group had no statistical significance compared with that of the control group（P＜0.05）.The body weight declined obviously with increasing of feeding time in the experimental group while the mice in the control group slightly increased.There were statistical significance in difference（P＜0.05）.The behavioristics results showed that the total movement distance of the experimental mice was weaker than that of the normal mice，whose difference had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionDEN-induced hepatic cirrhosis model in C57BL/6 mice is successfully established from hepatic fibrosis，and it can be used as an ideal animal model for the study of human hepatic cirrhosis.

Diethylnitrosamine； Liver cirrhosis/pathology； Mouse； Model； Guide

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.005

：A

：1009-5519（2015）06-0812-03

2015-01-30）

国家自然科学基金资助项目（81170425）。

谭嘉鑫（1984-），男，重庆沙坪坝人，主要从事肝胆外科临床工作；E-mail：330406265@qq.com。

白莲花（E-mail：qqg63@outlook.com）。