短时受精对体外受精及临床妊娠结局的影响

张 纯 张 帆 郑 洁 何 联

(1湖北省妇幼保健院生殖医学中心，湖北武汉430070;2华中科技大学同济医学院附属同济医院产科，湖北武汉430030)

体外授精是体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)治疗过程中极其关键的步骤与环节，传统IVF-ET采用精子、卵母细胞-卵丘-放射冠复合物(oocyte-cumulus corona complex，OCCC)培养液中过夜(16～18 h)孵育的受精方式。然而，哺乳动物受精可发生在配子相遇后20 min内［1］，人类精子15 min内即可穿入卵丘细胞团，80%卵母细胞暴露于精子中1 h左右受精［2］。伴随过夜受精过程中颗粒细胞、精子代谢产生的活性氧化物可造成不饱和脂肪酸过氧化，影响细胞膜的流动性，胞浆膜硬化，影响胚胎分裂、发育、孵出与植入［3］。自然状态下，伴随输卵管的收缩、舒张与蠕动，在输卵管内，卵丘细胞团仅与少量精子相互作用，人类受精过程即可完成。缩短精卵共培养时间(2～4 h，短时受精IVF)对胚胎质量及临床妊娠结局影响的研究结论不一，有研究提示短时受精可以提高优质胚胎率及临床妊娠率［4，5］，Barraud-Lange等［6］则认为短时受精不影响优质胚胎率及临床妊娠率。本研究回顾分析本中心短时IVF与传统过夜IVF对受精、卵裂、胚胎质量及临床妊娠结局的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2012年8月至2014年5月在湖北省妇幼保健院生殖医学中心因女性输卵管因素或盆腔炎症接受体外受精-胚胎移植患者的临床资料。除外卵巢反应不良、获卵过多，合并子宫内膜异位症及发生卵巢过度刺激综合征的患者。其中短时受精IVF组131周期，传统过夜受精IVF组129周期。其中短时受精IVF组中共有20个周期患者因宫腔积液等因素未移植，传统过夜受精IVF组中共有16个周期患者因宫腔积液等因素未移植。两组患者的平均年龄［(30.62 ±4.25)vs(30.84 ±4.41)岁］、周期数［(1.17 ±0.38)vs(1.12 ±0.33)周］、不孕年限［(3.63±1.16)vs(3.47 ±1.29)年］、平均获卵数［(12.31 ±4.10)vs(12.37 ±3.84)个］、平均移植胚胎个数［(1.98 ±0.13)vs(1.96 ±0.19)个］，经统计学比较，差异均无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵和取卵 患者均采用达必佳长方案降调节，促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)降调，达到降调标准后，启动促性腺激素(Gn)至人类绒毛膜促性腺激素(hCG)注射日，36 h后经阴道B超引导下取卵。

1.2.2 精液处理 患者丈夫禁欲3～7 d，取卵日手淫法取精，室温下液化，密度梯度离心法进行洗涤，处理后用于加精的精子密度调整至≥(5～10)×106/mL，置于37℃、5.2%CO2培养箱内上游，至少培养30 min后用于授精。

1.2.3 传统过夜受精 获取的OCCC体外培养3～4 h后按3～3.5万精子/卵细胞的比例加入精子，卵细胞与精子在含10%SPS的HTF培养液中共孵育16～18 h后，用拉细的巴氏吸管轻轻吹打卵丘复合物，除尽卵母细胞周围的卵丘细胞后，观察受精。

1.2.4 短时受精 获取的OCCC体外培养3～4 h后按4～4.5万精子/卵细胞的比例加入精子，OCCC与精子共孵育4 h后，用拉细的巴氏吸管轻轻吹打卵丘复合物，除尽卵母细胞周围的卵丘细胞，置于新鲜培养液微滴中，观察第二极体出现情况。若≤50%的卵母细胞出现第二极体，等待至授精6 h再次观察，若仍≤50%，则行补救ICSI。

1.2.5 受精评估及胚胎发育观察 在恒温倒置镜下观察受精情况，以未见原核、出现1个原核、2原核、≥3个原核分别作为0、1、2、多PN的受精标志。将所有合子移入新鲜的培养液微滴中单独培养，并在授精后48和72 h观察胚胎发育情况。

1.2.6 胚胎移植与黄体支持 根据卵裂球数目、大小、形态、是否均匀及有无碎片和发育速率进行胚胎质量评估。将卵裂速度正常，第2天≥3个卵裂球，或第3天出现至少6细胞，卵裂球大小均匀或轻度大小不均，无核碎片≤20%的胚胎定义为优质胚胎［4］。选择优质胚胎移植，移植胚胎数≤2个，剩余优质胚胎及按照Peter分级标准Ⅲ级以上，除多PN外包括0、1、2 PN来源，且符合评分标准的胚胎均行冷冻保存。行胚胎移植术的患者予黄体支持。若移植术后第14、18天测血β-hCG阳性，第35天B超观察宫腔内孕囊数和原始心管搏动以确定临床妊娠。

1.2.7 胚胎利用率及临床妊娠率的计算 胚胎利用率=(移植胚胎数+冷冻胚胎数)/总卵裂数，临床妊娠率=B超确认有孕囊的周期数/移植周期数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计分析软件处理数据，数据用¯x±s表示，计量资料之间的比较采用t检验，率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 短时IVF与传统过夜IVF受精情况比较

短时IVF组与传统过夜IVF组的2 PN率(68.44%vs 68.23%)、0 PN 率 (21.57%vs 21.99%)、1 PN 率(6.01%vs 6.08%)、多 PN 率(3.97%vs 3.70%)均无统计学差异(P ＞0.05)，见表1。

2.2 短时IVF与传统过夜IVF受精率、卵裂率、胚胎利用率及临床妊娠率比较

短时IVF、传统过夜 IVF组的受精率分别为85.24%、85.21%，卵裂率分别为 96.65%、97.21%，两者无统计学差异(P＞0.05)。两组胚胎利用率分别为83.45%、77.23%，前者明显高于后者(P ＜0.01)，两组临床妊娠率(46.85%vs 44.25%)比较，无统计学差异(P＞0.05)，见表2。

3 讨论

受精是精子与卵子相互作用的结果，是妊娠发生的开始，其过程极其复杂。传统过夜受精时，卵子暴露于较高浓度的精子(2万～10万/卵子)环境长达16～18 h，尽管其过程充分保证精卵有足够的受精时间，可获得较高的受精率，然而，一些研究表明［8-10］，传统过夜IVF受精由于精卵长时间共孵育，大量细胞代谢产物及过氧化物，如活性氧物质及其它有害因子，可消耗培养基能量与营养，使透明带硬化，损伤胚胎DNA，并可能影响胚胎的后续发育、孵出与植入等。为减少高浓度精子与OCCC的孵育时间及其代谢产物对OCCC、卵子及受精卵可能产生的负面影响，2003年 Chen等［11］首次提出在常规IVF后6 h，通过剥除颗粒细胞，观察第二极体是否排出预测受精结局，进而对受精失败的卵母细胞行早补救卵细胞浆内单精子注射。该研究组后续的研究显示，体外受精时精卵共培养2～4 h的短时受精与常规过夜培养具有相同的受精率及卵裂率［12］，随后，短时受精越来越受到关注［13］。短时受精联合早期补救性ICSI技术可作为较早地判定受精的早期证据，早期发现受精失败，早期补救，可以在很大程度上避免完全受精失败的发生，此技术已受到越来越多生殖中心的认可与推崇［14］。然而，国内外短时受精对人类辅助生殖过程中体外受精、卵裂、胚胎发育、囊胚形成、临床妊娠结局、流产等方面的研究尚缺乏多中心、大样本、随机、对照、双盲的研究结论，由于各中心短时受精时间、分组条件的控制等因素不同，很多研究结果间仍存在分歧，且短时受精的远期风险尚有待评估。至少短期内，短时受精不可能、也不应该完全取代传统过夜受精，而成为第一代试管婴儿技术不孕患者受精方式的唯一选择。对于相当一部分单纯输卵管因素的继发不孕症患者，传统过夜受精仍不失为首选的受精方式之一，尽管其仍存在技术、操作与细节上改良、优化的空间与可能。

本研究对比短时受精与传统过夜受精对体外受精、胚胎发育及临床结局的影响，结果显示，与传统过夜IVF比较，短时IVF组正常受精率(2 PN率)、0 PN率、1 PN率、多PN率、受精率、卵裂率、临床妊娠率均无显著性差异，但胚胎利用率明显提高。短时受精并即刻脱除颗粒细胞与传统受精方式比较，虽然不改变临床妊娠率，但可能通过提高卵子、胚胎的利用率，提高周期的累计妊娠率，不失为一种有益的改进，而成为部分患者受精方式的选择之一。

表1 短时IVF与传统过夜IVF受精情况比较 n(%)

表2 短时IVF与传统过夜IVF受精率、卵裂率、胚胎利用率及临床妊娠率比较 n(%)

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