UV 和HPLC 法测定黄芩黄酮总苷元提取物中总黄酮和3 种主要成分的含量

彭易兰，刘云华，黄志芳，刘玉红，陈 燕，易进海*

1成都中医药大学，成都 611137;2 四川省中医药科学院，成都 610041

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi 的干燥根，具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎的功效［1］，主要成分为黄芩苷、汉黄芩苷及少量的苷元等黄酮类成分［2］，其中黄芩苷的含量最高，故黄芩及其成方制剂中都以黄芩苷作为质控指标。药代动力学研究证明，苷类成分在肠道内难以吸收、生物利用度低、肠内滞留时间较长而易受到肠道菌群的作用，苷经肠道细菌代谢后被水解，生成苷元而发挥其药理作用［3，4］;如文献报道黄芩苷在肠道内难以被直接吸收，转化为黄芩素才能被吸收入血液而发挥作用［5-7］，同时大量临床药效实验证明，黄芩素的药理作用强于黄芩苷［5］。因此，将黄芩黄酮苷类成分转化苷元，提高其生物利用度和药理作用是有效提高黄芩药效的重要方法。黄芩黄酮苷元的主要成分黄芩素有抗菌消炎、抗病毒、降低血清胆固醇等作用［8，9］;汉黄芩素有抗氧化、抗肿瘤等生物活性［10］;千层纸素A 有抗肿瘤、神经保护等活性［11］。本文采用简便的工艺方法，利用黄芩药材中自身的黄芩酶水解黄芩苷，经提取得到黄芩黄酮总苷元，分别采用UV 法、HPLC 法测定总黄酮和黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A 的含量，从总黄酮和3 种主要有效成分的含量来表征黄芩黄酮总苷元提取物，为其质量控制提供科学的参考方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪系列(包括四元泵，DAD 检测器，柱温箱，自动进样器，工作站)，759S 紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，KQ-300B 型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有公司)，AUW200D 型1/10 万电子天平(日本岛津)，Milli-Q Integral 3 超纯水机(美国Millipore)，电子恒温水浴锅(DZKW-4)，真空干燥箱(上海2K-82A)。

1.2 试药

对照品黄芩素(批号111595-200905)购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用;对照品汉黄芩素(批号MUST-14110311)、千层纸素 A (批号MUST-14112104)均购自成都曼斯特生物科技有限公司，供含量测定用。黄芩药材购自成都荷花池药材市场，经四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi 的干燥根。甲醇为色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩黄酮总苷元提取物制备

黄芩药材粉碎过10 目筛，第一次加水12 倍，第二次和第三次各加水10 倍，于0～10 ℃动态搅拌提取三次，每次0.5 h，过滤，合并滤液，缓慢升温至60℃并保温酶解6 h，过滤，减压干燥，即得。

2.2 HPLC 测定黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A 的含量

2.2.1 溶液制备

2.2.1.1 对照品储备液

精密称取黄芩素对照品5.47 mg 置25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到黄芩素对照品储备液(每1 mL 中含黄芩素0.2188 mg);精密称取汉黄芩素5.20 mg 置25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到汉黄芩素对照品储备液(每1 mL 中含汉黄芩素0.2080 mg);精密称取千层纸素A 5.22 mg 置25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到千层纸素A 对照品储备液(每1 mL 中含千层纸素0.2088 mg)。

2.2.1.2 混合对照品溶液

分别精密吸取黄芩素，汉黄芩素，千层纸素A对照品储备液8、2、1 mL 置25 mL 容量瓶中加甲醇稀释至刻度，制成每1 mL 含黄芩素70.016 μg、汉黄芩素16.640 μg、千层纸素A 8.352 μg 的溶液，摇匀，即得。

2.2.1.3 供试品溶液

图1 混合对照品(A)、供试品(B)的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard (A)and sample (B)

取黄芩提取物约16 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀;精密吸取0.5 mL 置5 mL 容量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱条件:色谱柱Eclipse XDB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱温:35 ℃;流动相:甲醇-0.2%磷酸水(50∶50);流速:1 mL/min;检测波长:275 nm;分析时间40 min。

系统适用性试验:分别精密吸取混合对照品溶液5 mL 及供试品溶液10 μL 进样，记录色谱图，见图1。黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A 均能达到基线分离，理论板数均大于8000，分离度均大于2.8。

2.2.3 线性关系考察

分别精密量取混合对照品溶液0.5、2、4、6、8、10 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度(6 个浓度)对照品溶液。精密吸取对照品溶液10 μL 分别注入液相色谱仪，测得峰面积。以进样浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。

表1 黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A 的回归方程、相关系数和线性范围Table 1 Regression equation，correlation coefficient and linear range of baicalein，wogonin and oroxylin A

结果表明:黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A 分别在3.501～70.016，0.832～16.640，0.418～8.352 μg/mL 范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.4 精密度试验

精密吸取供试品溶液(No.2)10 μL，在上述色谱条件下连续进样6 次，黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A 色谱峰面积的RSD 分别为0.83%、0.34%、0.73%。结果表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验

精密吸取供试品溶液(No.2)10 μL，在上述色谱条件下在24 h 内每隔4 h 进样测定，黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A 色谱峰面积的RSD 分别为1.38%、0.78%和1.46%。结果说明在24 h 内检测稳定。

2.2.6 重复性试验

取同一批样品(No.2)，按“2.2.1.3”项下方法平行操作制备6 份供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，记录峰面积。黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A 的含量(n=6)分别为60.39%、13.00% 和6.38%;RSD 分别为0.94%、1.20%和1.29%。结果表明方法的重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验

称取黄芩提取物(No.2)，平行6 份，精密称定，分别精密加入黄芩素对照品的甲醇溶液(1.094 mg/mL)5 mL、汉黄芩素对照品的甲醇溶液(1.04 mg/mL)1 mL、千层纸素A 对照品的甲醇溶液(0.52 mg/mL)1 mL，以下按“2.2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。

表2 黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A 加样回收率结果Table 2 Recovery experiment results of baicalein，wogonin and oroxylin A

结果表明该方法回收率度良好。

2.2.8 样品中黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A 的测定

取各批次黄芩提取物样品，按“2.2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样，记录峰面积，含量测定结果见表3。

2.3 UV 法测定总黄酮含量

2.3.1 对照品溶液制备

精密称取黄芩素对照品5.34 mg 置25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到黄芩素对照品储备液;精密吸取黄芩素储备液1 mL 置50 mL 容量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL 中含黄芩素4.272 μg)。

2.3.2 供试品溶液

取黄芩提取物(No.2)约16 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀;精密吸取0.5 mL 置50 mL 容量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 最大吸收波长的选择

以甲醇作为空白溶剂，取黄芩素对照品溶液和供试品溶液(No.2)在紫外分光光度仪于200～400 nm 波长范围内扫描测定吸收曲线，结果表明黄芩素对照品溶液和供试品溶液在275 nm 处均有最大吸收，所以选择275 nm 作为总黄酮测定波长。

2.3.4 线性关系考察

分别准确吸取黄芩素对照品储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于25 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度(5 个浓度)对照品溶液，在275 nm 波长处测定吸光度，以溶液浓度(X)为横坐标，以吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=0.0976X +0.0153，r=0.9991。黄芩素浓度在1.7088～8.5440 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验

取供试品溶液(No.2)连续测定5 次，记录吸光度值，RSD 为0.3%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验

取同一供试品溶液(No.2)，室温放置0、2、4、6、8 h 分别测吸光度。记录吸光度值，吸光度分别为0.4443、0.4444、0.4482、0.4471、0.4487，RSD=0.46%，说明在8 h 内检测稳定。

2.3.7 重复性试验

准确称取同一样品(No.2)6 份，按“2.3.2”项下平行操作制备供试品溶液，在275 nm 检测，记录吸光度值，结果测得总黄酮的平均含量为91.12%，RSD=1.36%。结果表明方法的重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验

称取黄芩提取物(No.2)约8 mg，平行6 份，精密称定，精密加入与样品中含量约等量的黄芩素对照品，按“2.3.2”项下制备供试品溶液，在275 nm分别测吸光度，计算回收率，平均加样回收率(n=6)为100.93%，RSD 为2.63%，即该方法准确度良好。

2.3.9 总黄酮含量的测定

取各批次黄芩提取物样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，于275 nm 下测定吸光度，含量测定结果见表3。

表3 五批黄芩提取物中黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A 和总黄酮的含量Table 3 The contents of baicalein，wogonin，oroxylin A and total flavonoids

3 讨论与结论

黄芩药材中含有黄芩酶，在适宜的温度等条件下，黄芩酶水解黄芩苷转化为黄芩素，文献报道黄芩药材加水湿润，保温、酶解，再用乙醇回流提取得到黄芩苷元［12，13］，但该方法由于使用乙醇不仅生产成本高，而且带入脂溶性杂质导致黄芩素含量较低。本文应用新的工艺方法，在低温条件下(0～10 ℃)动态搅拌同时提取黄芩苷和黄芩酶，此时黄芩酶的活性被抑制，水提液经离心过滤后再升温至60 ℃，恢复酶的活力，保温酶解6 h，HPLC 检测表明黄芩苷全部水解为黄芩素，黄芩素难溶于水，析出沉淀，过滤，干燥，得到黄芩黄酮总苷元提取物，且有效成分含量高。

本文黄芩黄酮总苷元生产工艺简便，成本低，而且有效成分含量高，优于文献报道的方法［12，13］。建立了UV 法、HPLC 法测定上述黄芩黄酮总苷元提取物中总黄酮和黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A 的含量，方法简便、快速、准确，重现性好，结果表明其主要有效成分为黄芩素，含量为48.22%～60.36%，汉黄芩素含量为12.09%～14.46%，千层纸素A 含量为5.05%～8.81%，总黄酮含量为78.11%～90.12%，有效成分明确，可测成分含量高，从总黄酮和3 种主要成分的含量来表征黄芩黄酮总苷元提取物，为其应用和质量控制提供参考方法。

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