基于多元统计方法进行水牛乳掺水定量鉴别

（中国农业科学院广西水牛研究所，广西 南宁 530001）

基于多元统计方法进行水牛乳掺水定量鉴别

黄 丽，李 玲，冯 玲，曾庆坤*，林 波，唐 艳，农皓如，杨 攀

（中国农业科学院广西水牛研究所，广西 南宁 530001）

采用常规方法测定不同掺水体积比例的水牛乳掺伪样的7 个主要品质指标，并基于这些指标参数采用单因素方差分析、主成分分析和多元逐步线性回归法，对不同 掺水量的水牛乳进行定量鉴别，旨在寻求一种能有效监控水牛乳掺水的快速定量鉴别方法。利用单因素方差分析不同掺伪样的7 个重要理化指标的差异性，分析结果表明，水牛乳掺水的最低检出限为7%。主成分分析中，第1主成分贡献率达到85.464%，已包含样本的大部分信息，主成分1得分与掺水量存在显著的线性关系。通过多元逐步线性回归法建立了4个定量模型方程，其相关系数R2分别为0.965、0.982、0.986、0.989，平均绝对误差分别为-0.23%、-2.40%、0.23%、1.28%，可实现水牛乳掺水的定量鉴别。

水牛乳；掺水；理化指标；多元统计方法；定量鉴别

乳以其香甜可口、营养丰富，易于消化吸收的优势，日渐受到消费者的青睐，水牛乳更是堪称“乳中精品”，主要营养素蛋白质高于常规牛乳[1]，市场价格也普遍高于其他乳，非常具有发展前景。在利益驱使下，水牛原料乳掺假问题较为突出，但由于缺乏快速有效的检测方法，在水牛乳质量监控方面存在比较大的困难。掺水是最简单、最直接、最常用、最普遍的掺假方法，部分奶农和不法商贩为了谋求暴利向乳中掺水。检测掺水最常用的是感官检测、比重法和冰点测定法[2-4]；也有人利用电子舌[5]、力敏传感器[6]、近红外光谱技术[7]、低场核磁共振[8]、单频导纳测定[9]、氟离子选择电极法[10]等先进仪器设备进行牛乳掺水检测。但只依赖比重和冰点等指标只能做出初略判断，准确度不高。仪器分析法存在成本高、检测速度慢等问题，不能实现水牛乳的快速检测。水牛乳中掺水后其含水量的改变，也影响了其他成分的含量，通过乳理化特性，乳中的特有成分与主要营养成分的检测可以进行基本的乳的品质检测与掺假鉴别。因此，测定水牛乳滴定酸度、冰点、蛋白质、乳糖，全乳固体等主要的、特殊的营养物质含量，能够较全面反映水牛乳的品质。本实验结合多元统计分析方法对指标测定结果进行综合分析，为获得一种水牛乳掺水的定量鉴别方法提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水牛乳取自广西壮族自治区水牛研究所种畜场；超纯水；氢氧化钠（分析纯） 天津博迪化工股份有限公司；酚酞（分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

超纯水一体机 美国Milli-Q公司；Milko Scan FT120多功能乳品分析仪 丹麦Foss公司；Model 4250单通道牛乳冰点测试仪 美国Advanced公司。

1.3 方法

1.3.1 水牛乳取样

在2014年3、4、5月份间随机采取处于正常泌乳期的健康水牛鲜生乳样，每天早上8点采样，共采集10 批次。

1.3.2 水牛乳掺水样制备

每批生鲜水牛乳采样后立即运回实验室，并立即用500 目滤布过滤去除杂质，取一定量的水牛乳，分别掺入体积分数比例为0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%的超纯水，每个比例水牛乳掺水样250 mL，在3 min内充分混匀，用于各个指标的测定，获得共120（15 份/批次×8批次）份掺水样品。另取2 批次水牛乳采用同样的配制方法制备不同掺水比例的验证样，共计17 份。

1.3.3 水牛乳滴定酸度测定

按照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》的方法，平行2 次。

1.3.4 水牛乳冰点测定

采用单通道牛乳冰点测试仪测定，平行2 次。

1.3.5 水牛乳蛋白质、脂肪、全乳固体、非脂乳固体、乳糖含量测定

采用多功能乳品分析仪测定，平行2 次。

1.4 数据处理

采用Excel 2010处理原始数据，采用IBM SPSS 20.0软件进行单因素方差分析和主成分分析（principal component analysis，PCA），利用Origin 8.6软件制作相关图表。

2 结果与分析

2.1 水牛乳掺水样的品质指标

水是水牛乳中的分散介质，是水溶性组分的溶解介质，水牛乳中掺水后，增加了溶剂的质量，致使其理化性质也发生了变化。表1为掺水样和掺水样水牛乳的滴定酸度、冰点、蛋白质、脂肪、全乳固体、非脂乳固体、乳糖含量等指标的测定结果。随着掺水量的增加，稀释了乳中的成分，水牛乳掺水样的滴定酸度、蛋白质、脂肪、全乳固体、非脂乳固体、乳糖含量等均表现出下降的趋势；乳糖和可溶性盐类含量降低，使得掺水样冰点呈现总体上升的规律，这与陈晓聪等[11]的研究相吻合。还有学者[12-13]研究了牛乳的理化指标相关性，冰点与其他多个品质指标具有显著相关性。本研究综合分析这些指标的变化规律，结合单因素显著性分析、PCA、多元逐步线性回归法对数据进行处理，研究多个品质指标的变化以建立水牛乳掺水定量鉴定方法。这些多元统计方法在食品鉴伪分类上应用越来越广，结合其他技术，如差示扫描量热法[14-15]、荧光光谱法[16]等，均能起到很好的鉴别效果。

表1 水牛乳掺水样的品质指标测定结果Table 1 Quality indexes of buffalo milk with added water

2.2 基于单因素方差分析的水牛乳掺水检出限确定

单因素方差分析也称作一维方差分析。它检验由单一因素影响的一个（或几个相互独立的）因变量由因是否具有统计意义，还可以对该因素的若干水平分组中哪一组与其他各组均值间具有显著性差异进行分析[17]。利用SPSS软件中Duncan多重比较方法[18]对120 份不同掺水量水牛乳样的7 个指标参数在显著水平0.05下进行显著性分析，分析结果如表1所示。由表1的方差分析可知，当水的掺伪量达到2%、4%、5%、6%时，滴定酸度和冰点、全乳固体和非脂乳固体、乳糖、脂肪、蛋白质含量与未掺水纯水牛乳样的分别有显著差异。表明达到一定的掺水量时，水牛乳掺水样与未掺水样品质指标的均值间表现出显著性差异，从而可根据对应指标的数值变化来初步检验水牛乳的掺水情况。综合分析可知，当水的掺伪量在7%以上时，7 个指标均分别与未掺水样的有显著性差异，因此，从单因素方差分析对水牛乳掺水的检验来看，最低检出限为7%。

2.3 基于PCA的水牛乳掺水鉴定

PCA是一种通过降维技术把多个变量化为少数几个主成分（即综合变量）的统计方法，这些主成分能反映原始变量的绝大部分信息，通常表示为原始变量的某种线性组合[19]。对主成分作得分散点图，可直观上反映出样品的大量信息，从而找出能够确定水牛乳中掺水的情况。

采用SPSS软件对120 份不同掺水量水牛乳样的7 个指标数据进行PCA，共得到7 个主成分值。主成分个数提取的原则为主成分对应的特征值大于1的前m 个主成分，特征值被看成是表示主成分影响力度大小的指标，如果特征值小于1，说明该主成分的解释力度还不如直接引入一个原变量的平均解释力度大，因此一般选择特征值大于1的主成分进入下一步分析；另外，特征值贡献率反映了每个主成分包含原始变量信息的量度，一般来说要求累计贡献率不小于85%[15-17]。因此，按照累计贡献率大于85%，特征值大于1的原则，抽提前1个主成分，抽提主成分的特征根、贡献率、累计贡献率及特征向量见表2。

表2 主成分的特征值、贡献率及载荷矩阵Table 2 Eigen value, contribution rate and coefficient matrix of first principal component

由表2可知，PC1贡献率为85.464%，即表示这一个主成分基本保留了原始变量的信息，已含样本85.464%的信息量，够能完全表示水牛乳掺水情况的组分信息，一个主成分说明变量间相关性很强，一个因子足以代表7 个指标变量的信息，达到了降维的目的。根据7 个指标含量原始数据的标准化矩阵，两个主成分的特征值和指标含量的载荷矩阵，获得主成分的组合系数矩阵，可得到相应的得分函数[15]：

式中：X*1～X*7分别表示滴定酸度、冰点、蛋白质、脂肪、全乳固体、非脂乳固体、乳糖含量等标准化的原始变量。

根据得分函数可得到15 组水牛乳掺水样的主成分得分。以第1主成分得分为横坐标，水牛乳掺水量为纵坐标作散点图，见图1，图中每一个方框代表一个掺水样的整体特性，其中8个记号点分别代表此掺水量的8 批样品。不同样品的差异可通过图上横坐标的间隔距离表征，两类样品的间距越远则差别越大。对不同掺水量的水牛乳样品进行较好地区分，随着掺水量的增加，样品的分布在PC1上从正半轴向负半轴推移，表现出了一定的规律，呈现等距离平移现象。但由于8 批水牛乳指标数值是一个波动的范围，而非一个固定值，需要从整体上反应的掺水量与PC1得分的关系，见图2。

图1 8 批水牛乳掺水样PC1得分-掺水量散点图Fig.1 Scatter plot based on principal component score and the content of added water of eight batches of samples

图2 水牛乳掺水样PC1得分-掺水量关系图Fig.2 Plot of principal component score versus the content of added water of samples

从图2可知，根据横坐标间隔，即PC1平均得分，能够较好地区分不同掺伪量的水牛乳掺水样，掺水量在2%以上时，掺水样的平均得分与未掺水样的差别均表现明显。掺水量与PC1平均得分呈显著的线性关系，相关系数R2为0.999 05，说明7 个指标与掺水量具有显著的线性相关性，经过PCA提取PC1代替原来的多个自变量，达到以消除变量间的相关性， 消除多重共线性问题，可进一步进行回归分析，利用线性方程建立定量模型。

2.4 基于多元逐步回归法的水牛乳掺水鉴定

2.4.1 水牛乳掺水定量模型的建立

表3 水牛乳掺水的逐步多元线性回归分析Table 3 Summary of stepwise regression analysis of buffalo milk with added waatteerr

为了能够定量鉴别出纯水牛乳中掺入不同的水量，将7 个指标参数（ 滴定酸度、冰点、蛋白质、脂肪、全乳固体、非脂乳固体、乳糖含量）作为建立定量鉴别模型的变量。采用IBM SPSS 20.0对这些变量进行多元逐步线性回归拟合[20-22]，得到的逐步线性回归方程见表3。

2.4.2 水牛乳掺水定量模型的可行性检验

为了检验基于7 个主要品质指标参数建立的定量鉴别模型的可行性，共采用2 批水牛乳分别掺入不同体积比例水的掺伪样进行检验，验证结果见表4。

表4 水牛乳掺水定量模型预测值与实测值的误差Table 4 Comparison of predicted and actual amounts of added water in buffalo milk %

对多元逐步线性回归拟合建立的4 个水牛乳掺水定量鉴别模型计算得到的测定值进行了绝对误差分析，由表4可知，在11%～40%掺水量的验证中，4 个模型的绝对误差范围分别为-2.56%～1.96%、-4.15%～-0.39%、-2.04%～2.26%、-1.05%～3.24%，平均绝对误差分别为-0.23%、-2.40%、0.23%、1.28%，说明该方法建立的定量鉴别模型可行，进行可为实际检测的鉴伪定量判别分析提供依据。其中，模型Ⅰ中仅需测定冰点就能够知晓掺水情况，由于掺水后牛乳的含水量增加，冰点随着上升，国外很多学者[23-27]利用这一性质建立模型进行掺水牛乳的定量检测，但由于冰点易受其他掺伪物质的影响，检测结果不是很准确，本研究综合考虑水牛乳的关键品质指标的变化规律，结合多元统计分析方法，拟合出的模型Ⅰ避免了单一考虑冰点的缺陷，能够用于水牛乳掺水的快速定量检测。

3 结 论

通过测定120 份水牛乳掺水样的7 个重要理化指标，采用单因素方差分析从7 个指标的数值变化规律确定了水牛乳掺水最低检出限为7%；采用PCA将多重共线性关系的7 个指标降维为1个主成分，PC1平均得分与掺水量存在显著的线性关系，并从两者的关系图中将不同水牛乳掺水样进行直观区分；多元逐步线性回归拟合构建的4 个水牛乳定量鉴别模型平均绝 对误差分别为-0.23%、-2.40%、0.23%、1.28%，能够实现最低检出限以上的水牛乳掺水情况的定量鉴别。

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Quantitative Identification of Added Water in Buffalo Milk Based on Multi Statistical Analysis

HUANG Li, LI Ling, FENG Ling, ZENG Qingkun*, LIN Bo, TANG Yan, NONG Haoru, YAN Pan
(Guangxi Buffalo Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530001, China)

Seven main quality indicators of buffalo milk added with different volume ratios of water were measured by conventional methods based on one-way analysis of variance analysis (ANOVA), principle component analysis (PCA), and multiple linear regression for quantitative identifi cation of added water in buffalo milk. One-way ANOVA was used to determine the signifi cant differences in the main quality indicators of different samples with added water to obtain a limit of detection (LOD) of 7%. According to the PCA, the contribution rate of the fi rst PC was 85.464%, and it included most of the sample information. There was a signifi cant linear relationship between the scores of the fi rst PC and the content of added water. Four quantitative model equations were built by multiple linear regression, with correlation coeffi cients (R2) of 0.965, 0.982, 0.986 and 0.989 and mean absolute errors of -0.23%, -2.40%, 0.23% and 1.28%, respectively, which could be used for quantitative identifi cation of added water in buffalo milk.

buffalo milk; added water; physical and chemical indicators; multi statistical analysis; quantitative identifi cation

TS252.7

A

1002-6630（2015）12-0205-04

10.7506/spkx1002-6630-201512038

2014-08-11

“十二五”农村领域国家科技计划项目（2013BAD18B12-03）；广西科技攻关计划项目（桂科攻12118011-2A）

黄丽（1986—），女，研究实习员，硕士，研究方向为乳品科学。E-mail：huangli00206@163.com

*通信作者：曾庆坤（1968—），男，研究员，硕士，研究方向为水牛乳理化特性、水牛乳制品。E-mail：zqk456@163.com