离子色谱法-积分安培检测器测定葡萄酒中的天然糖

马甲民，崔 鹤*，张文皓，李 立，董丽臻，李慧新

（1.山东出入境检验检疫局，山东 青岛 266001；2.青岛大学，山东 青岛 266071；3.中国检验检疫科学研究院，北京 100123）

离子色谱法-积分安培检测器测定葡萄酒中的天然糖

马甲民1,2，崔 鹤1,*，张文皓1，李 立3，董丽臻1，李慧新1

（1.山东出入境检验检疫局，山东 青岛 266001；2.青岛大学，山东 青岛 266071；3.中国检验检疫科学研究院，北京 100123）

建立测定葡萄酒中常见的8种天然糖（阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、果糖、L-山梨糖、蔗糖、异麦芽酮糖和麦芽糖）的离子色谱分析方法。以淋洗液发生器电解产生的KOH溶液梯度淋洗，在CarboPac PA20高效阴离子交换柱上，8种天然糖可以在30 min内完成分离。使用积分安培检测器进行测定，8种糖的检出限（进样量10μL，RSN=3）分别为0.007、0.004、0.005、0.005、0.003、0.014、0.016 mg/L和0.020 mg/L，且均具有较宽的线性范围（0.06～30 mg/L）。样品测定的相对标准偏差在4.9%～8.7%之间，8种糖的加标回收率在81.5%～95.1%之间；本方法检测糖简便快捷、分离效果好、无需衍生、灵敏度高，适用于葡萄酒中的8种常见天然糖组分的分析。

离子色谱；积分安培检测器；葡萄酒；天然糖

自然界中，天然糖种类繁多，已发现的单糖主要是戊糖和己糖。天然存在的游离态和具有机能的二糖以哺乳类的乳糖、细菌和昆虫血液等的海藻糖、植物的蔗糖、麦芽糖等为代表。这些是作为各种生物体的能量来源，或者作为生物体组成的物质原料，承担着所必需的糖类的贮藏或运输的重要作用。葡萄酒中的糖种类、含量对酒的风味有较大的影响[1]。从葡萄酒行业内的信息看出在酿造过程中加入某些糖类对提高香气复杂性、浓郁度有很好的帮助[2-3]。根据GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》，规定异麦芽酮糖为甜味剂，按生产需要适量使用[4]。对照国外食品添加剂要求，D-木糖、L-阿拉伯糖和L-山梨糖未列入GB 2760—2011，也没有限量要求[5-6]。因此，对各国进口葡萄酒进行本底调查，测定葡萄酒中天然糖的种类、含量的信息显得尤为必要。

由于食品基质比较复杂，样品前处理较为繁琐，食品中天然糖的测定比较困难[7]。葡萄酒中天然单糖和二糖的测定研究不是很多，目前常见的食品中糖测定方法有化学法（比色法、滴定法）[8-9]、液相色谱串联光检测器法[10-11]、离子色谱法[12-13]、液相色谱-质谱联用法[14-16]、离子色谱-质谱联用法[17-18]、酶催化-电化学法[19]等。电位滴定法方法简单、成本较低、操作简便，可以直接测定出葡萄酒中的还原糖总量，但是不能分别测定出各种糖的含量[9]；液相色谱或离子色谱与质谱联用对食品中糖的测定具有方法简便的特点，并且可以同时对糖定性定量分析，但是其前处理较为繁琐，所用质谱仪器设备成本较高[14-18]；高效液相色谱串联光检测器及脉冲安培检测器是目前最为广泛的测定食品样品中糖含量的方法之一，但是其所测定的食品样品大多为固体样品，没有将其应用于葡萄酒中天然糖进行分离分析[20]。

在加氧化还原电压条件下，糖类分子具有电化学活泼性，且其在强碱溶液中呈离子化状态[21]。在OH-存在的条件下，它们会部分或全部以阴离子形式存在，可以在阴离子交换色谱柱上被分离。离子色谱法检测糖主要使用金电极的安培检测器。当在金电极上施加电压，糖易在金电极表面发生氧化反应；在碱性条件下，金电极催化活性非常高；而且糖的检测过程中不需衍生反应和复杂的样品纯化处理。

本研究利用石墨化炭黑做填料的固相萃取（solid phase extraction，SPE）柱对葡萄酒样品进行处理，通过阴离子交换色谱法同时对进口葡萄酒中的8种天然糖进行分离，并通过积分安培检测器对8种糖进行检测，建立一种葡萄酒样品中糖的离子色谱分析方法。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

葡萄酒样品 市售进口葡萄酒。实验所有用水均为经Milli-Q去离子水制备装置制备的电导率不小于18.2 MΩ·cm的去离子水；葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、L-山梨糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽酮糖（帕拉金糖）标准品 德国Dr.Ehrenstorfer公司，购自上海悌希爱试剂公司；甲醇（色谱纯） 德国Merck公司；石墨化炭黑及C18填料 美国Agilent公司。

1.2仪器与设备

ICS5000+离子色谱仪（带有DP-5四元梯度泵、AS-AP自动进样器、在线淋洗液KOH发生装置EGC500+、积分安培电化学检测器及Chromeleon数据处理系统）、Dionex CarboPac PA20色谱柱美国Thermo公司；Milli-Q去离子水制备装置。

1.3方法

1.3.1色谱条件

淋洗液：KOH溶液；色谱柱：Dionex CarboPac PA20；柱温：30℃；检测器：积分安培检测器；工作电极：Au电极；参比电极：Ag/AgCl电极；梯度洗脱条件见表1，检测器检测波形见表2。

表1 KOH溶液梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

表2 糖测定的积分安培检测波形Table 2 Integrated pulsed amperometric detection waveforms for sugars

1.3.2 样品前处理

依次使用3 mL去离子水、1 mL甲醇分别活化石墨化炭黑SPE柱，取葡萄酒样品2.0 mL稀释5倍后，取5.0 mL经SPE柱及0.22μm滤膜过滤，收集滤液。将滤液稀释后经离子色谱分析。

2 结果与分析

2.1分离条件的选择

淋洗液中OH-有两种作用：首先，作为淋洗离子，OH-浓度增大，淋洗能力增强，糖在色谱柱上的保留时间缩短；其次，OH-提供糖解离为离子所需要的pH值环境，OH-浓度增大，糖分子的离子化程度提高，其在色谱柱上的保留时间延长。因此，糖在色谱柱上的保留时间是两种行为共同作用的结果。由于单糖分子结构、官能团构型十分相似，采用等度洗脱时分离效果较差，因此，采用KOH梯度洗脱的方法，分离效果如图1所示。在选定的色谱条件下，果糖与L-山梨糖虽然未完全分离，但分离度能够满足要求，其余组分分离效果非常好，且所有目标峰峰形良好，灵敏度较高。

图1 8 种糖标准品分离色谱图Fig.1 Ion chromatographic separation of eight sugar standards

2.2前处理方法的优化

在利用离子色谱法对葡萄酒样品中糖的测定时，起干扰作用的杂质主要有偶氮染料（色素）和氨基酸。偶氮染料浓度过大会对离子色谱柱造成伤害，因此实验过程中必须进行脱色。于20.0 mL离心管中分别加入0.2 g C18和石墨化炭黑填料，然后加入稀释20倍的红葡萄酒样品10.0 mL，超声10 min后离心，取上层清液观察吸附前后溶液颜色的变化，结果见图2；将C18及石墨化炭黑作为填料装填成SPE柱并利用其对红葡萄酒样品进行前处理，取滤液经稀释后进行离子色谱分析，分析结果见图3。

图2 吸附剂吸附前后溶液颜色的变化Fig.2 Color variations of wine before and after adsorption

由图2和图3对比可以得出，石墨化炭黑可以更好地去除葡萄酒样品中的杂质，测试结果受杂质影响更小。这是由于偶氮染料多含有苯环，近似平面结构，而石墨分子本身具有片层结构，这就使偶氮染料较容易吸附在石墨化炭黑表面，进而将颜色脱去。但是其在脱色的同时，又会吸附部分糖分子，造成回收率较差的问题。而回收率差的问题可以用回收系数进行校正。C18做填料脱色效果较差，离子色谱峰受杂质的影响较大，但是其对糖的回收率较高。综合各种影响因素，对葡萄酒中糖的的测定中，选用石墨化炭黑做SPE柱的填料。

图3 不同SPE柱处理过后样品离子色谱图对比Fig.3 Comparison of ion chromatograms based on separation with different SPE columns

2.3标准曲线

在选定条件下对混合标准溶液进行离子色谱分析，测试8种糖的标准曲线，标准曲线参数见表3。由标准曲线及其参数可知，在线性范围内，相关系数R2≥99.87%。8种糖的检出限（进样量10μL，RSN=3）分别为0.007、0.004、0.005、0.005、0.003、0.014、0.016 mg/L和0.020 mg/L，且均具有较宽的线性范围（0.06～30 mg/L）。

表3 标准曲线的线性范围、检出限、定量限Table 3 Linear curve equations, limits of detection and limits of quantification for surgars

2.4加标回收率及精密度

为了测试出离子色谱法串联安培检测器方法的准确性，并测试出准确性参数，选取一不含木糖、L-山梨糖、蔗糖、异麦芽酮糖和麦芽糖，且阿拉伯糖、葡萄糖及果糖含量低的样品作为空白基质样品，测定其阿拉伯糖、葡萄糖及果糖含量，定为本底质量浓度。平行取3份样品，分低、中、高3个水平，分别添加一定量混合标准溶液，使各组分添加量分别为200.0、500.0、1 000.0 mg/kg。添加标准溶液后，按2.2节步骤进行前处理，平行6次，测定加标回收率及相对标准偏差，测定结果见表4。

表4 加标回收率及相对标准偏差Table 4 Recover and precision, expressed as relative standard deviation (RSD), of this method

由表4可以看出，在线性范围内的加标回收率在81.5%～95.1%之间，相对标准偏差在4.9%～8.7%之间，表明方法精密度可满足分析要求，回收率虽然较差，但是可以通过大量实验数据归纳校正因子的方法进行校正。

2.5样品分析

表5 样品分析实验结果Table 5 Anlytical results obtained for real samples mg/L

续表5mg/L

由表5得出，进口葡萄酒中主要含有一种国标中未列入的天然糖：阿拉伯糖，并含有大量的葡萄糖和果糖，少量葡萄酒样品中含有L-山梨糖，未检出蔗糖与麦芽糖。其中阿拉伯糖为葡萄生长过程中产生，非人工添加结果检出。

3 结 论

通过实验得出葡萄酒中含有葡萄糖、果糖和阿拉伯糖3种天然糖。甜型或半甜型（半干型）葡萄酒样品中3种糖的总量远高于干型葡萄酒中的含量，这是由于干型葡萄酒在酿造过程中比甜型葡萄酒增加了一步脱糖工艺。少量葡萄酒样品中含有L-山梨糖，含量较低。通过本方法检测葡萄酒样品中糖的含量具有前处理方法简单，易于操作的优点，适用于葡萄酒样品中8种常见天然糖的含量测定。

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Determination of Naturally Occurring Sugars in Wine by Ion Chromatography with Integrated Pulsed Amperometric Detection

MA Jiamin1,2, CUI He1,*, ZHANG Wenhao1, LI Li3, DONG Lizhen1, LI Huixin1
(1. Shandong Extry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266001, China; 2.Qingdao University, Qingdao 266071, China; 3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

We developed a method for the determination of eight naturally occurring sugars in wine by ion chromatography with integral amperometric detection. We used potassium hydroxide (KOH) produced by eluent generator electrolysis for gradient elution. On CarboPac PA20 anion exchange column, all eight target compounds could be separated completely in 30 minutes. The limits of detection ( LODs) of these analytes by the integral amperometric detector were very low, and a wide linear range was found. The relative standard deviations (RSDs) for six replicate determinations varied from 4.9%to 8.7%, and the recoveries of these eight sugars from spiked samples ranged from 81.5%to 95.1%. Our method proved to be simple, fast, sensitive and suitable for the analysis of the eight naturally occurring sugars in wine by achieving good separation without derivatization.

ion chromatography (IC); integral amperometric detector (IAD); wine; naturally occurring sugar

O657.75

A

1002-6630（2015）12-0108-05

10.7506/spkx1002-6630-201512020

2014-09-28

国家重大科学仪器研发专项（2012YQ090229）；国家质检公益性科研专项（201210012）

马甲民（1988—），男，硕士研究生，研究方向为离子色谱及应用。E-mail：jiaminma@126.com

*通信作者：崔鹤（1962—），男，研究员，博士，研究方向为色谱及色谱联用技术。E-mail：cuihe88@aliyun.com