山莨菪碱对心搏骤停猪心肺复苏后肺损伤的保护作用及其作用机制研究

张 杰，刘亚华，代 正，周满红，尹雪莲，张 维，沈 洪

·论著·

山莨菪碱对心搏骤停猪心肺复苏后肺损伤的保护作用及其作用机制研究

张 杰，刘亚华，代 正，周满红，尹雪莲，张 维，沈 洪

目的 探究山莨菪碱对心搏骤停猪心肺复苏(CPR)后肺损伤的保护作用及其作用机制。方法 选择健康雄性家猪23头，按照随机数字表法分为假手术组(A组，n=5)、肾上腺素组(B组，n=9)和山莨菪碱+肾上腺素组(C组，n=9)。采用交流电致颤法建立心搏骤停模型。A组家猪只切开左颈外静脉，不进行致颤及CPR；B组和C组家猪制备心搏骤停模型后立即进行CPR，同时B组家猪注射肾上腺素，C组家猪注射肾上腺素+山莨菪碱。ROSC成功家猪和A组家猪在基础时点、心搏骤停 8 min、自主循环恢复(ROSC)即刻、ROSC 30 min和ROSC 24 h留取血液标本，检测血浆肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)水平；ROSC 24 h处死所有家猪，留取肺组织标本，检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、TNF-α及IL-6含量，肺含水量及湿/干重比(W/D)；光镜下观察肺组织形态学变化。结果 (1)B组和C组家猪均成功致颤，心电图均表现为心室纤颤。B组ROSC成功7头，C组ROSC成功5头。(2)基础时点3组家猪血浆TNF-α水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；心搏骤停8 min、ROSC即刻、ROSC 30 min及ROSC 24 h B组和C组家猪血浆TNF-α水平低于A组，ROSC即刻、ROSC 30 min及ROSC 24 h C组家猪血浆TNF-α水平低于B组(P<0.05)。基础时点、心搏骤停8 min及ROSC即刻3组家猪血浆IL-6水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；ROSC 30 min及ROSC 24 h B组和C组家猪血浆IL-6水平高于A组，ROSC 24 h C组家猪血浆IL-6水平低于B组(P<0.05)。(3)B组和C组家猪肺组织SOD含量低于A组，肺组织MDA含量、MPO含量、W/D、肺含水量及TNF-α和IL-6含量高于A组(P<0.05)。C组家猪肺组织SOD含量高于B组，肺组织MDA含量、MPO含量、W/D、肺含水量及TNF-α含量低于B组(P<0.05)。(4)光镜下显示，B组家猪肺泡壁毛细血管扩张，肺泡渗出增多，炎性细胞浸润；而C组家猪上述表现明显减轻。结论 山莨菪碱可能通过抑制TNF-α、IL-6过度释放，减轻脂质过氧化等来减轻心搏骤停猪CPR后肺损伤，进而发挥保护作用。

心搏骤停；心肺复苏术；山莨菪碱；缺血再灌注损伤；肺保护；猪

张杰，刘亚华，代正，等.山莨菪碱对心搏骤停猪心肺复苏后肺损伤的保护作用及其作用机制研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2015，23(10)：40-44.[www.syxnf.net]

Zhang J，Liu YH，Dai Z，et al.Protective effect and its mechanism of anisodamine on lung injury after CPR in pigs with sudden cardiac arrest[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(10)：40-44.

近年来，疾病预防领域虽取得一些进展，但心搏骤停(sudden cardiac arrest)在世界很多地区死亡原因中仍位居首位[1]。大量动物实验和临床研究发现，心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation，CPR)后存在不同程度肺损伤,CPR后大量炎性递质被激活、多种细胞因子共同参与肺炎性损伤过程[2]；另外，心搏骤停、CPR后肺脏仍存在缺血再灌注损伤，且心、脑、胃肠等其他远隔脏器发生缺血再灌注损伤亦会对肺脏产生影响。山莨菪碱又名654-2，是我国从茄科植物唐古特莨菪中分离出来的生物碱，临床研究显示，其对创伤[3]、脓毒血症、缺血再灌注[4-6]等多种机制引起的肺损伤均有良好的保护作用。本实验通过建立心搏骤停猪模型，观察山莨菪碱对心搏骤停猪CPR后肺损伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性家猪23头,月龄3～4个月，体质量24～27 kg，由中国人民解放军总医院动物实验室提供。按照随机数字表法将23头家猪分为假手术组(A组，n=5)、肾上腺素组(B组，n=9)和山莨菪碱+肾上腺素组(C组，n=9)。

1.2 主要试剂和仪器 肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)试剂盒(武汉基因美生物提供)，髓过氧化物酶(MPO)试剂盒(上海碧云天生物技术研究所提供)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(K335-100，美国BioVision公司)，起搏电极(心诺普北京医疗技术有限公司)，Heart Start XL除颤仪(PHILIPS)，气管插管导管(管径6.0，英国泰美科公司)。电热恒温培育箱(PH4000AB型，天津泰斯特仪器有限公司)，电动匀浆器(Ultra Turrax®T10basic，德国IKA公司)。

1.3 动物模型制备 切开家猪左颈外静脉并插入起搏电极至右心室，应用右心室交流电致颤法建立心搏骤停模型[7]。成功诱发心搏骤停标准：平均动脉压<10 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，伴正常动脉搏动波消失，心电图示心室纤颤。

1.4 实验方法及结果判定标准 A组家猪只切开左颈外静脉，不进行致颤及CPR。B组和C组家猪诱发心搏骤停成功9 min后立即进行CPR，同时经气管导管接呼吸机辅助通气，呼吸机模式为容量控制模式，设定潮气量15 ml/kg、呼吸频率16次/min、氧吸入浓度100%、胸外心脏按压频率>100次/min、按压幅度为猪胸廓前后径1/4。在行CPR同时B组家猪经左颈内静脉导管弹丸式注射肾上腺素(0.045 mg/kg)[8]，C组家猪经左颈内静脉导管弹丸式注射肾上腺素(0.045 mg/kg)+山莨菪碱(0.4 mg/kg)[9]，持续胸外按压2 min后电除颤1次(双相，150 J)[7]。若CPR未成功，继续胸外按压，按照固定频率推注复苏药物(1次/3 min)及电除颤(1次/2 min)。CPR 30 min后仍未出现自主循环恢复(resumption of spontaneous circulation，ROSC)，停止CPR。ROSC标准：停止心脏按压后，出现窦性、房性或交界性心律伴平均动脉压>60 mm Hg或脉压>20 mm Hg，且持续时间超过10 min[7]。恢复自主循环2 h后撤机。

1.5 标本采集及检测

1.5.1 TNF-α和IL-6 ROSC成功家猪及A组家猪在基础时点、心搏骤停8 min、ROSC即刻、ROSC 30 min和ROSC 24 h留取静脉血3 ml，采用EDTA抗凝管收集血液，摇匀，4 °C 1 000×g离心10 min，然后移取血浆至另一新的1 ml离心管(血浆检测样本)，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆TNF-α和IL-6水平或肺组织TNF-α和IL-6含量。

1.5.2 肺组织 ROSC成功家猪及A组家猪均在ROSC 24 h后处死，在左肺下叶相同部位取约5 g肺组织，称取湿重后，置于60 ℃电热恒温培养箱内干燥72 h，再称取干重，计算肺组织湿/干重比(wet/dry weight ratio，W/D) 和肺含水量，肺含水量=(肺湿重-肺干重) / 肺干重×100%。取左肺上叶相同部位肺组织标本以冰生理盐水冲洗，采用电动匀浆器，13 000×g离心10 min，去掉沉淀，留取上清夜备用。采用黄嘌呤氧化酶法检测肺组织SOD含量，采用硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量，采用依赖H2O2反应产物比色法检测MPO含量。

1.5.3 肺组织形态学观察 每组家猪在处死时立即在左肺上叶相同部位取10 cm3肺组织放入10%甲醛溶液中固定。石蜡切片，二甲苯10 min，100%乙醇1 min，95%乙醇1 min，85%乙醇1 min，75%乙醇1 min脱蜡。蒸馏水冲洗5 min，然后采用苏木素染色3 min，自来水冲洗3 min，1%盐酸乙醇分化30 s，水洗蓝化5 min，75%乙醇1 min，1%伊红乙醇1 min，95%乙醇1 min，100%乙醇1 min，二甲苯石炭酸1 min，二甲苯(Ⅰ)1 min，二甲苯(Ⅱ)1 min，中性树脂封片。光镜下观察肺组织结构破坏、肺间质水肿情况及炎性细胞浸润程度。

2 结果

2.1 实验结果 B组和C组家猪均成功致颤，心电图均表现为心室纤颤。B组ROSC成功7头，C组ROSC成功5头。CPR失败6头，其中2头可能是肋骨骨折导致肺脏刺伤，其余4头失败原因不确定。ROSC成功后家猪均存活24 h，24 h后开胸，肺脏表面结构完整，无肋骨骨折导致肺脏刺伤情况。

2.2 3组家猪不同时间点血浆TNF-α和IL-6水平比较 基础时点3组家猪血浆TNF-α水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。心搏骤停8 min、ROSC即刻、ROSC 30 min及ROSC 24 h 3组家猪血浆TNF-α水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中B组和C组家猪血浆TNF-α水平低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。ROSC即刻、ROSC 30 min及ROSC 24 h C组家猪血浆TNF-α水平低于B组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。基础时点、心搏骤停8 min及ROSC即刻3组家猪血浆IL-6水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。ROSC 30 min及ROSC 24 h 3组家猪血浆IL-6水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中B组和C组家猪血浆IL-6水平高于A组，差异有统计学意义(P>0.05)。ROSC 24 h C组家猪血浆IL-6水平低于B组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

Table 1 Comparison of plasma TNF-α level among the three groups at different time points

组别头数基础时点心搏骤停8minROSC即刻ROSC30minROSC24hA组54.31±0.104.30±0.094.37±0.044.25±0.054.32±0.06B组54.27±0.104.47±0.07a5.92±0.05a7.89±0.31a27.39±1.44aC组74.26±0.094.46±0.06a5.61±0.22ab6.93±0.09ab22.84±0.84abF值0.348.11145.51341.38277.24P值0.710.010.000.000.00

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；A组为假手术组，B组为肾上腺素组，C组为山莨菪碱+肾上腺素组；ROCS=自主循环恢复

Table 2 Comparison of plasma IL-6 level among the three groups at different time points

组别头数基础时点心搏骤停8minROSC即刻ROSC30minROSC24hA组53.85±0.903.84±0.073.86±0.083.85±0.063.86±0.09B组53.83±0.093.92±0.063.96±0.084.86±0.26a27.39±1.44aC组73.81±0.063.84±0.073.88±0.084.59±0.41a23.33±1.75abF值0.252.022.6014.35424.70P值0.780.160.100.000.00

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05

2.3 3组家猪肺组织SOD含量、MDA含量、MPO含量、W/D、肺含水量及TNF-α和IL-6含量比较 3组家猪肺组织SOD含量、MDA含量、MPO含量、W/D、肺含水量及TNF-α和IL-6含量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。其中B组和C组家猪肺组织SOD含量低于A组，肺组织MDA含量、MPO含量、W/D、肺含水量及TNF-α和IL-6含量高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。C组家猪肺组织SOD含量高于B组，肺组织MDA含量、MPO含量、W/D、肺含水量及TNF-α含量低于B组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

2.4 3组家猪肺组织形态学 A组家猪肺泡结构完整，肺泡壁及间质内无炎性细胞浸润(见图1)；B组家猪肺泡壁毛细血管扩张，肺泡腔水肿、渗出及大量粒细胞浸润(见图2)；C组与B组比较，肺组织充血、肺间质水肿减轻，肺泡内渗出明显减少(见图3)。

图1 A组家猪肺组织形态学表现(HE染色，×40)

3 讨论

3.1 山莨菪碱对CPR后炎性因子的影响 CPR后体内免疫细胞会释放大量炎性因子，且各种炎性因子可产生化学反应，互相激活、趋化而产生瀑布样链锁反应。TNF-α作为始动因子[10]，通过趋化、激活中性粒细胞(PMN)向肺部聚集而产生呼吸爆发，且还可以促使机体释放大量氧自由基，诱导其他炎性递质(如IL-6)大量分泌等，进而引起肺内皮细胞受损、血管通透性增加、通气/血流比例失调、动脉血氧分压下降[11-12]。有临床研究表明，山莨菪碱能通过抑制转录因子κB(NF-κB)

图2 B组家猪肺组织形态学(HE染色，×40)

图3 C组家猪肺组织形态学(HE染色，×40)

表3 3组家猪肺组织SOD含量、MDA含量、MPO含量、W/D、肺含水量及TNF-α和IL-6含量比较

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛，MPO=髓过氧化物酶，W/D=湿/干重比

活化，下调TNF-α基因的转录及蛋白质合成，从源头阻遏炎性因子的瀑布样链锁反应[13]。汤彦等[14]通过制备油酸所致急性肺损伤家兔模型，证实山莨菪碱能有效降低家兔急性肺损伤时血浆TNF-α、IL-8水平，改善肺组织病理改变。张寰波[15]的研究结果发现，山莨菪碱能抑制TNF-α、IL-6 等促炎性细胞因子的过量产生或释放及调节抗炎细胞因子——IL-10的表达，减轻肺水肿、改善氧合指标，从而保护急性肺损伤患者的肺功能。MPO是PMN胞质中的一种特异性酶，与来自NADPH的H2O2一起构成PMN的颗粒系统。本研究结果显示，光镜下C组家猪肺内炎症相对减轻、肺泡渗出液及炎性细胞浸润较B组减轻，且CPR后肺组织TNF-α和IL-6含量均高于A组，提示两种炎性递质可能均参与介导CPR后肺损伤的炎性病理变化。与B组比较，C组大鼠ROSC后各时间点血浆TNF-α水平均下降，同时ROSC 24 h肺组织TNF-α含量、MPO含量及W/D亦降低，提示山莨菪碱可能通过抑制TNF-α、IL-6的过度分泌而降低肺毛细血管通透性、减轻肺水肿，从而减轻CPR后肺损伤。

3.2 山莨菪碱对氧化应激反应的干预 离体及在体缺血再灌注动物实验发现，肺泡上皮及肺血管内皮细胞因氧自由基代谢失衡而出现肺毛细血管痉挛及肺泡上皮细胞变性坏死，毛细血管渗漏，进而引发肺水肿[16]。SOD和MDA是常用的评价氧化应激损伤的重要指标。当机体SOD含量降低，氧自由基清除能力出现下降，细胞多不饱和脂肪酸形成脂质过氧化反应，而MDA作为代表性脂质过氧化代谢产物能进一步破坏细胞膜的完整性、损害细胞超微结构。以往研究发现，山莨菪碱作为抗氧化剂可以保护肺泡巨噬细胞免受内毒素的直接氧化损伤[17]，从而维持抗氧化能力平衡。刘树元等[18]研究显示，心搏骤停患者行CPR早期应用山莨菪碱可提高24 h存活率，复苏早期即能明显减轻体内氧化应激反应。本研究结果显示，C组家猪肺组织SOD含量高于B组，MDA含量低于B组，提示山莨菪碱能通过提高SOD含量、抑制氧自由基产生，从而减轻肺再灌注后脂质过氧化损伤。

综上所述，CPR后多种因素参与肺损伤过程。山莨菪碱可能通过抑制TNF-α、IL-6过度释放，减轻脂质过氧化等来减轻心搏骤停猪CPR后肺损伤，进而发挥保护作用。

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(本文编辑：谢武英)

Protective Effect and Its Mechanism of Anisodamine on Lung Injury after CPR in Pigs with Sudden Cardiac Arrest

ZHANGJie，LIUYa-hua，DAIZheng，etal.DepartmentofEmergency，GeneralHospitaloftheChinesePeople′sLiberationArmy，Beijing100853，China

Objective To investigate the protective effect and its mechanism of anisodamine on lung injury after CPR in pigs with sudden cardiac arrest.Methods A total of 23 healthy male pigs were divided into A group(n=5)，B group(n=9)and C group(n=9)according to random number table.Alternating current-induced ventricular fibrillation method was used to prepare the animal models of sudden cardiac arrest.Pigs of A group only received incision of left external carotid vein，did not received alternating current-induced ventricular fibrillation or CPR；pigs of B group and C group received immediate CPR after preparation of sudden cardiac arrest models，and pigs of B group received extra injection of epinephrine，while pigs of C group received extra injection of epinephrine and anisodamine.Blood specimens of successful ROSC pigs and A group were collected to detect the plasma levels of TNF-α and IL-6 at basis point，after 8 minutes of sudden cardiac arrest，at once of ROSC，after 30 minutes of ROSC and after 24 hours of ROSC.After 24 hours of ROSC，all of the pigs were killed and lung tissue samples were collected to detect the SOD，MDA，MPO，TNF-α and IL-6 contents，water content and wet/dry weight ratio(W/D).Light microscope was used to observe the morphological features of lung tissue.Results (1)Pigs of B group and C group were all successfully induced ventricular fibrillation affirmed by electrocardiogram.Of B group，7 pigs got successful ROSC；of C group，5 pigs got successful ROSC.(2)No statistically significant differences of plasma TNF-α level was found among the three groups at basis point(P>0.05)；plasma TNF-α level of B group，C group was statistically significantly lower than that of A group after 8 minutes of sudden cardiac arrest，at once of ROSC，after 30 minutes of ROSC and after 24 hours of ROSC，respectively，and plasma TNF-α level of C group was statistically significantly lower than that of B group at once of ROSC，after 30 minutes of ROSC and after 24 hours of ROSC，respectively(P<0.05).No statistically significant differences of plasma IL-6 level was found among the three groups at basis point，after 8 minutes of sudden cardiac arrest or at once of ROSC(P>0.05)；plasma IL-6 level of B group，C group was statistically significantly higher than that of A group after 30 minutes of ROSC and after 24 hours of ROSC，respectively，and plasma IL-6 level of C group was statistically significantly lower than that of B group after 24 hours of ROSC(P<0.05).(3)SOD content of lung tissue of B group，C group was statistically significant lower than that of A group,respectively，while MDA，MPO，TNF-α，IL-6 contents，water content and W/D of B group and C group were statistically significantly higher than those of A group(P<0.05)；SOD content of lung tissue of C group was statistically significant higher than that of B group，while MDA，MPO，TNF-α water content and W/D of C group were statistically significantly lower than those of B group(P<0.05).Light microscope found alveolar walls capillaries expanded，alveoli exudation elevated and infiltration of inflammatory cells of B group，while above features of C group were relatively relieved.Conclusion Anisodamine can relieve lung injury after CPR in pigs with sudden cardiac arrest through inhibiting the excessive release of TNF-α and IL-6，alleviating of lipid peroxidation，and eventually play a role of protective effect.

Cardiac arrest；Cardiopulmonary resuscitation；Anisodamine；Ischemia-reperfusion injury；Lung protection；Swine

卫生行业基金科研专项(201002011)

100853北京市，中国人民解放军总医院急诊科(张杰，沈洪)；武警总医院急救医学中心(刘亚华)；四川省人民医院急诊科(代正)；遵义医学院附属医院(周满红)；北京同仁医院(尹雪莲)；解放军总后司令部管理保障局第一门诊部(张维)

沈洪，100853北京市，中国人民解放军总医院急诊科；E-mail：shenhong@em120.com

R 541.78

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.10.010

2015-08-16；

2015-10-14)