HPLC法同时测定半枝莲中原儿茶酸和香草酸的含量*

刘勇，付小凯，李阳，闫辉，容蓉，巩丽丽，蒋海强，吕青涛

(山东中医药大学，济南 250355)

HPLC法同时测定半枝莲中原儿茶酸和香草酸的含量*

刘勇，付小凯，李阳，闫辉，容蓉，巩丽丽，蒋海强，吕青涛

(山东中医药大学，济南 250355)

建立高效液相色谱法同时测定半枝莲中原儿茶酸和香草酸含量的方法。采用Zorbax SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.2%磷酸水溶液-甲醇作淋洗液梯度洗脱，流量为1.0 mL／min，紫外检测波为260 nm，柱温为25℃。半枝莲中原儿茶酸和香草酸质量浓度分别在2.66～31.92 μg／mL，2.86～34.32 μg／mL与色谱峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数r=0.999 7，检出限分别为0.56,0.57 μg／mL。原儿茶酸、香草酸的加样回收率分别为101.4%，99.4%，测定结果的相对标准偏差分别为1.76%，2.21% (n=9)。该方法适用于半枝莲中原儿茶酸和香草酸的含量测定。

高效液相色谱法；半枝莲；原儿茶酸；香草酸

半枝莲(Scutllaria barbata D.Don)为唇形科植物的干燥全草，味辛、苦，性寒，具有清热解毒、化瘀利尿之功效，多用于治疗疔疮肿毒、咽喉肿痛、跌扑伤痛、水肿、黄疸、蛇虫咬伤［1］。半枝莲中含有原儿茶酸、香草酸等多种有机酸类化合物［2-3］。研究表明，原儿茶酸具有抗菌、抗氧化、介导肿瘤细胞凋亡等作用［4-6］；香草酸是中药胡黄连的有效成分之一，对酪氨酸酶具有明显的抑制作用［7-8］。目前半枝莲中原儿茶酸的含量测定方法已有文献报道［9-10］，但半枝莲中香草酸的含量测定方法尚未建立。笔者根据其它药材中二者含量同时测定的方法［11-12］，建立了HPLC法同时测定半枝莲中原儿茶酸及香草酸含量的方法，为半枝莲药材的质量控制标准提供依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，配有DAD检测器、四元泵、自动进样器、柱温箱、在线真空脱气机，美国安捷伦科技公司；

电子天平：AE240型，瑞士梅特勒公司；

原儿茶酸、香草酸标准品：批号分别为YJ0623YB14、S20J6G1，纯度均大于98%，上海源叶生物科技有限公司；

半枝莲药材：产地及批号分别为湖北100920，130501，安徽1212010，河北131202，江苏20140101，经山东中医药大学药学院鉴定皆为唇形科植物半枝莲；

甲醇：色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司；

磷酸：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 对照品溶液的制备

分别取原儿茶酸标准品和香草酸标准品适量，精密称定，分别以甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，分别制得质量浓度为53.2 μg／mL的原儿茶酸对照品溶液和质量浓度为57.2 μg／mL的香草酸对照品溶液。精密量取原儿茶酸对照品溶液和香草酸对照品溶液各500 μL，以甲醇稀释并定容至2 mL容量瓶中，制得混合对照品溶液。

1.3 供试品溶液的制备

将半枝莲药材粉碎，过3号筛。取半枝莲粉末约3 g，精密称定，置于250 mL 圆底烧瓶中，加入甲醇60 mL，水浴回流提取3次，每次2.0 h，合并3次提取液，过滤并浓缩，以色谱甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，制得供试品溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.2%磷酸水溶液(A)-甲醇(B)，流量为1.0 mL／min；梯度洗脱：0～45 min，B为20%～40%；柱温：25℃；检测波长：260 nm；进样体积：10 μL。在此色谱条件下，对混合对照品溶液及供试品(批号为20140101)溶液进行测定，色谱图见图1、图2。

图1 混合对照品液相色谱图

图2 供试品高效液相色谱图

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

分别考察了甲醇和无水乙醇加热回流提取效果，结果显示采用甲醇加热回流提取，测得原儿茶酸和香草酸含量(分别为68.6，78.8 μg／g)高于无水乙醇加热回流提取时的含量(分别为42.3， 27.0 μg／g)。因此选择甲醇对半枝莲进行提取。

2.2 流动相的选择

分别以乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水作为流动相，考察了等度洗脱和梯度洗脱供试品中原儿茶酸和香草酸的分离情况，结果发现采用甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱时，原儿茶酸和香草酸二者的分离度均在1.5 以上，待测组分色谱峰形良好，因此选用甲醇-0.2%磷酸水作为流动相进行梯度洗脱。

2.3 检测波长的选择

使用DAD检测器，在190～400 nm范围内采集光谱图，结果显示原儿茶酸和香草酸在260 nm左右有最大吸收，因此选择260 nm作为检测波长。

2.4 工作曲线方程及检出限

分别精密量取原儿茶酸和香草酸对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.2 mL，置于2 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线，摇匀，按1.4 色谱条件测定各峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标、原儿茶酸或香草酸的质量浓度(X)为横坐标进行线性回归分析，得原儿茶酸线性回归方程为Y=34 073X-22.251 (r=0.999 7)，线性范围为2.66～31.92 μg／mL；香草酸线性回归方程为Y=35 762X-15.685 (r=0.999 7)，线性范围为2.86～34.32 μg／mL。分别精密量取原儿茶酸和香草酸对照品溶液，逐步稀释，按1.4 色谱条件进行测定，直至信噪比S／N≥3，此时进样浓度即为对照品的检出限，测得原儿茶酸的检出限为0.56 μg／mL，香草酸的检出限为0.57 μg／mL。

2.5 精密度试验

取同一批号(1212010)半枝莲药材的供试品溶液，按1.4色谱条件，连续测定6次，记录原儿茶酸和香草酸的峰面积，测定结果见表1。由表1可知，原儿茶酸和香草酸测定结果的相对标准偏差分别为0.64%和1.23%，表明该方法精密度良好。

表1 精密度试验结果

2.6 稳定性试验

取同一批号(20140101)半枝莲药材的供试品溶液，按1.4色谱条件，分别在0，2，4，8，12，24 h 进样分析，记录原儿茶酸和香草酸的色谱峰面积，结果见表2。峰面积测定结果的相对标准偏差分别为0.82%和1.05%，表明样品在24 h内稳定。

表2 稳定性试验结果

2.7 重复性试验

取同一批号(20140101)半枝莲粉末(过3号筛)3 g，精密称定6 份，按1.3方法制备供试品溶液，按1.4色谱条件下进行测定，结果见表3。由表3可知，药材中原儿茶酸的平均含量为68.9 μg／g，其相对标准偏差为1.24%；香草酸的平均含量为80.3 μg／g，其相对标准偏差为1.46%，表明该方法重复性良好。

表3 重复性试验结果

2.8 加标回收试验

取已知含量同一批号(20140101)半枝莲粉末3 g，精密称量9份，按照样品中各成分含量的低、中、高3个水平，分别精密加入原儿茶酸和香草酸对照品溶液，按1.3方法制备供试品溶液，按1.4色谱条件进行测定，结果见表4。由表4可知，原儿茶酸和香草酸的平均回收率分别为101.4%和99.4%，测定结果的相对标准偏差分别为1.76%和2.21%(n=9)，表明该方法具有较高的准确度。

表4 原儿茶酸和香草酸的加标回收试验结果

2.9 样品测定

按1.3方法制备5批半枝莲药材供试品溶液，按1.4色谱条件测定原儿茶酸和香草酸的色谱峰面积，计算样品中二者的含量，结果见表5。由表5可知，不同产地及批号的半枝莲中原儿茶酸和香草酸的差异较大，其中江苏产半枝莲中二者含量均较高。

表5 半枝莲药材中原儿茶酸和香草酸的含量测定结果(n=3)

3 结语

建立了HPLC 法同时测定半枝莲中原儿茶酸和香草酸含量的方法，方法的灵敏度高，精密度和准确度满足实验要求。实验结果表明不同产地及批号的半枝莲中原儿茶酸和香草酸的含量差异较大，其中江苏产半枝莲中的原儿茶酸及香草酸的含量均较高。

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［2］ 杨顺利.中药半枝莲杭肿瘤活性成分的分离研究［D］.广州: 广东工业大学，2002.

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Determination of Protocatechuic Acid and Vanillic Acid in Scutllaria Barbata D.Don by HPLC

Liu Yong， Fu Xiaokai， Li Yang， Yan Hui， Rong Rong， Gong Lili， Jiang Haiqiang， Lyu Qingtao
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China)

A method for simultaneously determination of protocatechuic acid and vanillic acid in scutllaria barbata D.Don was established. A Zorbax SB-C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm) was adopted with mobile phase of methanol -0.2% phosphoric acid with gradient elution at the flow rate of 1.0 mL／min，the detection wavelength was set at 260 nm and the column temperature was 25℃. The calibration curves for protocatechuic acid and vanillic acid were linear in the range of 2.66-31.92，2.86-34.32 μg／mL，respectively. Both of the correlation coefficients were 0.999 7， the detection limits were 0.56, 0.57 μg／mL，respectively. The average recoveries of protocatechuic acid and vanillic acid were 101.4% and 99.4%，respectively，the relative standard deviations were 1.76% and 2.21% (n=9). The method is suitable for determination of protocatechuic acid and vanillic acid in Scutllaria barbata D.Don.

HPLC method; scutllaria barbata D.Don; protocatechuic acid; vanillic acid

O657.7

：A

：1008-6145(2015)04-0020-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2015.04.006

*国家自然科学基金项目(81173614)

联系人：吕青涛；E-mail: luqingtao9@ 163.com

2015-04-12