血清雌二醇标准物质的研制*

彭絮，徐蓓，江红,宋德伟

(1.北京交通大学理学院，北京 100044； 2.中国计量科学研究院化学所，北京 100013)

血清雌二醇标准物质的研制*

彭絮1，2，徐蓓2，江红1,宋德伟2

(1.北京交通大学理学院，北京 100044； 2.中国计量科学研究院化学所，北京 100013)

介绍高浓度血清雌二醇标准物质的研制。采集的全血不加任何添加剂和抗凝剂，离心分离出血清，分装。采用同位素稀释-液相色谱串联质谱法(ID-LC-MS／MS)对高浓度血清雌二醇标准物质进行定值及均匀性和稳定性检验，对定值不确定度进行了评定。结果表明，高浓度血清雌二醇标准物质定值结果为3.06 ng／g，扩展不确定度为0.08 ng／g (k=2)，均匀性和稳定性符合国家标准物质技术要求。采用IFCC RELA比对样品和欧洲标准局标准物质血清17β-雌二醇标准物质对定值方法进行确认，测量结果的标准偏差在该标准物质量值的不确定度范围内。研制的标准物质量值经过日本计量院验证，测量结果为(3.03±0.1) ng／g。该标准物质的量值具有溯源性和准确性。

血清；雌二醇；同位素稀释-液相色谱串联质谱法；定值；均匀性；稳定性

血清中雌二醇含量是临床检测中主要的生化指标之一，测定血清中雌二醇的含量对诊断某些妇科及内分泌系统疾病很有价值［1］。临床测量雌二醇的方法主要有免疫分析方法［2-3］、高效液相色谱法［4］、气相色谱法［5］、GC／MS法［6-7］和LC／MS／MS法［8-10］。不同的方法其测量结果间差异较大，因此需要研制相应的标准物质，对实验仪器进行校准，以提高和保证临床检验的准确性，实现测量结果的可溯源性和可比性。

目前国内无相应的血清雌二醇标准物质，国外只有正常浓度范围的，没有病理状态下高含量的血清雌二醇标准物质，造成测量标准范围窄，不能满足临床要求，为此笔者研制了高浓度孕妇血清雌二醇标准物质。采用同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC-MS／MS)法对研制的标准物质进行定值，根据ISO-Guide 35(2006)［11］及JJF 1343-2012［12］进行均匀性、稳定性检验及定值不确定度评定。采用IFCC RELA比对JCTLM(国际检验医学溯源联合委员会)样品和欧洲标准局标准物质血清17β-雌二醇标准物质对定值方法进行确认，保证了测定结果的准确性。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：API5000型，AB应用生物系统，美国ABSCIEX公司；

SPE固相萃取柱：C18Cartridges Sep-Pak VAc 3 mL(500 mg)，美国Waters公司；

10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)：纯度为99%；

乙腈、乙酸乙酯、甲醇：色谱纯；

无水碳酸钠、碳酸氢钠：分析纯；

孕妇血清标准物质：冰冻混合人血清，中国军事医学科学院输血医学研究所；

17β-雌二醇标准物质(CRM578)：人血清冻干粉，欧洲标准局；

2013 IFCC RELA比对JCTLM样品A：人血清冻干粉；

17β-雌二醇NMIJ CRM 6004-a：纯度98.4%，扩展不确定度0.3%(k=2)，日本国家计量院；

17β-雌二醇标记物：E2-16，16，17-d3，纯度99.4%，加拿大CDN isotopes公司。

1.2 血清雌二醇标准物质

与中国军事医学科学院输血医学研究所合作制备，将采集的全血不加任何添加剂和抗凝剂，离心分离出血清，得到5项指标(艾滋、梅毒、乙肝、丙肝、转氨酶)正常的孕妇留样血清。在无菌环境中，混合所有血清样品，过滤除菌，边搅拌边分装，用5.0 mL离心管包装，每支2.5 mL，于-80℃冷冻保存。

1.3 定值方法

1.3.1 校准溶液配制

配制17β-雌二醇标准及标记物／乙腈储备液，质量分数为10.0 ng／g，于-80℃保存。固定标记物的量，使其中雌二醇标准与标记物的质量比从0.5到1.5，配制系列标准溶液，于45℃下氮气吹干后衍生。

1.3.2 样品处理

取血清标准物质约0.3 mL于瓶中称量，加入1.5 mL水后再分别加入含α-萘酚2 μg及炔诺孕酮31 μg (100 nmol)溶液，以E2-16，16，17-d3为内标，用重量法与血清标准物质混合，加入量与对应校准曲线中的量相同，再加入0.5 mol／L乙酸钠缓冲液0.4 mL(pH5.0)，混匀后在室温下平衡2 h。

采用固相萃取(SPE)法提取雌二醇。常规润洗活化后上样，用20 mL水淋洗并抽干，2.5 mL甲醇洗脱。洗脱液以氮气于45℃吹干后用0.5 mL 0.1 mol／L Na2CO3-NaHCO3(pH10.5)缓冲液复溶，再用3 mL乙酸乙酯萃取净化2次，氮气吹干。用乙腈复溶后，加入0.1 mol／L Na2CO3-NaHCO3(pH10.5)缓冲液，10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)进行衍生(60℃反应3 min)，冷却后加入乙腈-水(体积比1∶1)，衍生样品用0.22 μm有机滤膜过滤后进行液相色谱-质谱测定。

1.3.3 定值测定条件

(1)色谱 条 件。 色谱柱：Agilent ZORBAX ECLIPSE XDB-C18柱 (2.1 mm×150 mm，5 μm)；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱：0→15 min，40%→100%B，15→17 min，100%B，流量为0.3 mL／min；色谱柱温度：30℃。

(2)质谱条件。ESI源，正离子多重反应监测扫描(MRM)模式；MRM监测的母离子、子离子质荷比(m／z)分别为17β-E2 558→223，E2-16，16，17-d3561→223；喷雾电压(IS)：5 000V；温度：550℃；去簇电压(DP)：150 V；射入电压(EP)：10 V；CE：558→223(58 V)；561→223(60 V)；碰撞室射出电压(CXP)：13 V；气帘气压力(CUR)：0.07 Pa；雾化气压力(Gas1)：0.38 Pa；辅助气压力(Gas2)：0.34 Pa；碰撞气压力(CAD)：0.07 Pa。

2 均匀性检验及定值结果

从分装的标准物质中随机抽取10瓶，每一瓶测定3个子样；采用单因素方差分析法评估样品的均匀性［11-12］。

组间方差和：

组内方差之和：

其中n，m，N为每个样品测量次数、组数和样品总测量个数；s1，s2为组间和组内标准偏差；v1，v2为自由度。

根据自由度(v1，v2)及给定的显著水平α，可由F分布临界值表查得临界值Fα。若F＜Fα，则认为数据组间无明显差异。

每个标准物质样品与其标准溶液同一批测定。样品重复进样3次，计算结果的平均值作为有效数据。先测定1.3.1中由低到高的系列校准溶液，通过不同质量比下得到的质谱响应峰面积比对其质量比做图，得到校准曲线，再对血清样品进行测定，将测得的质谱响应峰面积比代入校准曲线方程，计算出雌二醇与雌二醇标记物的质量比，从而得到该血清样品中雌二醇的质量分数。图1为血清中雌二醇与雌二醇标记物的选择离子色谱图，测定结果见表1。

图1 血清中17β-雌二醇与17β-雌二醇标记物的选择离子色谱图

表1 血清雌二醇标准物质定值测量结果

根据表1数据计算得总平均值为3.06 1 ng／g，因此血清样品中雌二醇标准物质的定值结果约等于3.06 ng／g，瓶间相对标准偏差为0.009%。

由均匀性检验数据可按公式计算出瓶间方差和、瓶内方差和、F值：

瓶间：Q1=0.020 75，v1=m-1=9，s12=0.002 31；

瓶内：Q2=0.016 69，v2=N-m=21，s22=0.000 83；

计算得F=2.78。

查表得Fα=3.71，F＜Fα，可以判定研制的血清雌二醇标准物质是均匀的。

3 稳定性考察

依据文献［12-13］对血清样品进行稳定性考察，在6个月内对血清中雌二醇测定3次，每次随机取3支血清样品，用t检验法进行稳定性评价。

s——测量方法的标准偏差；

tα(n-1)——t检验临界值；

n——测量次数。

表2 血清雌二醇标准物质稳定性考察结果

4 定值结果的不确定度评定

血清中17β-雌二醇定值结果的不确定度，由A类不确定度与B类不确定度组成，包括测量结果的重复性引入的不确定度，称量引入的不确定度，线性回归、均匀性等引入的不确定度等［14］，各不确定度分量评定结果见表3。

经计算，相对合成不确定度：urel=1.3%，不确定度：u=1.3%×3.06 ng／g=0.04 ng／g。

定值结果的扩展不确定度：U=uk=0.08 ng／g，k=2。

表3 定值不确定度分量

5 定值方法验证

采用ID-LC-MS／MS方法测定了2013 IFCC RELA比对JCTLM样品A及欧洲标准局标准物质血清中17β-雌二醇标准物质CRM 578［15］，测定结果见表4。由表4可知，测定结果的标准偏差在标准物质量值不确定度范围内。研制的血清中雌二醇标准物质经过日本计量院测量比对，测量结果为(3.03±0.1) ng／g。

表4 雌二醇比对样品及标准物质测量结果

6 结语

研制了高浓度血清雌二醇标准物质，采用同位素稀释-液相色谱质谱法(ID-LC-MS／MS)对其进行了定值，按照国际、国内的技术标准和规范进行了均匀性、稳定性检验及其不确定度的评定；采用2013 IFCC RELA比对JCTLM样品和欧洲标准局标准物质血清17β-雌二醇标准物质进行了方法验证，测量结果可溯源到JCTLM认可的标准物质，并经过国际同行的验证，保证了标准物质的溯源性和量值的准确。

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RoHS测试方法又发布IEC 62321-6: 2015

IEC 62321-6：2015版本于2015年6月5日正式发布，即多溴联苯和多溴联苯醚的确认测试方法。

IEC 62321-1: 2013 简介和概述；

IEC 62321-2: 2013 样品的拆卸，拆解和机械拆分；

IEC 62321-3-1: 2013 使用XRF对电子产品中的铅、镉、汞、总铬和总溴进行筛选；

IEC 62321-3-2: 2013 使用C-IC对聚合物和电子产品中的总溴进行筛选；

IEC 62321-4: 2013 使 用CV-AAS，CV-AFS，ICPOES，ICP-MS确定聚合物、金属和电子材料中的汞；

IEC 62321-5: 2013 使用AAS，AFS，ICP-OES，ICPMS确定聚合物和电子材料中的镉、铅和铬，以及确认金属材料中的镉和铅；

IEC 62321-6: 2015 使用GC-MS，IAMS和HPLC测定聚合物和电子材料中多溴联苯和多溴联苯醚。

(仪器信息网)

Development of Serum 17β-estradiol Reference Material

Peng Xu1，2， Xu Bei2， Jiang Hong1， Song Dewei2
(1.College of Science， Beijing Jiaotong University， Beijing 100044， China；2.Division of Chemistry， National Institute of Metrology， Beijing 100013， China)

The development of high concentration of serum 17β-estradiol reference material was introduced. The serum standard samples were isolated from collected blood by certain conditions before packing，the checking of uniformity，stability test and certified value were systematically studied by ID-LC-MS／MS. The uncertainty of determination was evaluated. The results showed that the certified value of the reference material of high concentration of serum 17β-estradiol reference material was 3.06 ng／g with an relative expanded uncertainty of 0.08 ng／g (k=2). The uniformity and stability of the reference material of serum 17β-estradiol could meet the technical requirements of the standard reference material. IFCC RELA sample and European Commission CRM were used for confirmation of dermination method, and the standard deviation of analysis result was in the range of uncertainty. The 17β-estradiol reference material value was proven by the Metrology Institute of Japan, and the detection result was (3.03±0.1) ng／g. The quantity value of the reference material is traceable and accuracy.

serum; estradiol; ID-LC-MS／MS; certification; homogeneity; stability

O656

：A

：1008-6145(2015)04-0001-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2015.04.001

*国家科技基础条件平台工作项目(2011FY130100)

联系人：徐蓓；E-mail: xubei@nim.ac.cn

2015-03-25