SKF96365和氯化镍对环匹阿尼酸诱导的大鼠PASMC[Ca2+]i升高的影响

彭公永，胡锦兴，邹义敏，彭 芳，周玉民，胡国平，赵祝香

(广州医科大学附属第一医院/广州呼吸疾病研究所/呼吸疾病国家重点实验室/呼吸疾病国家临床医学研究中心，广东广州 510120)

SKF96365和氯化镍对环匹阿尼酸诱导的大鼠PASMC[Ca2+]i升高的影响

彭公永，胡锦兴，邹义敏，彭 芳，周玉民，胡国平，赵祝香

(广州医科大学附属第一医院/广州呼吸疾病研究所/呼吸疾病国家重点实验室/呼吸疾病国家临床医学研究中心，广东广州 510120)

目的 研究SKF96365和氯化镍(NiCl2)对环匹阿尼酸(CPA)诱导的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞(PASMC)内游离钙离子浓度([Ca2+]i)变化的影响。方法培养大鼠PASMC，运用荧光显微镜和InCyte细胞内钙浓度检测系统观测CPA、SKF96365和NiCl2对PASMC [Ca2+]i的影响。结果含5 μmol/L硝苯地平的无钙Krebs溶液孵育PASMC，10 μmol/L CPA使PASMC[Ca2+]i短暂小幅升高，恢复细胞外Ca2+至2.5 mmol/L后，10 μmol/L CPA使PASMC [Ca2+]i迅速显著升高；50 μmol/L SKF96365和500 μmol/L NiCl2均能明显抑制10 μmol/L CPA引起的PASMC [Ca2+]i升高，但对高钾(60 mmol/L KCl)溶液引起的PASMC [Ca2+]i升高无影响。结论CPA可致大鼠PASMC [Ca2+]i升高，且能被SKF96365和NiCl2阻断，提示CPA可能诱发细胞外Ca2+经钙池操纵性钙通道(SOCC)内流，SKF96365和NiCl2能选择性抑制SOCC活性使经SOCC的Ca2+内流减少。

环匹阿尼酸；游离钙离子浓度；肺动脉平滑肌细胞；硝苯地平；钙池操纵性钙通道；大鼠

中国40岁以上人群慢性阻塞性肺疾病(COPD)患病率高达8.2%[1-2]，多数人经缺氧性肺动脉高压发展为慢性肺源性心脏病。急性缺氧性肺血管收缩反应和慢性缺氧性肺血管结构重塑是缺氧性肺动脉高压发生的两大主要环节[3-6]，而缺氧对远端肺动脉收缩和重塑的影响比近端肺动脉更明显[7-8]，表明远端肺动脉是肺动脉高压发病的主要部位。Ca2+在肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMC)的缺氧性收缩反应和增殖过程中发挥关键作用[9-11]。环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid，CPA)是平滑肌肌浆网上的一种特异性Ca2+ATP酶阻断剂，能够激活平滑肌细胞膜钙池操纵性钙通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)，参与调节平滑肌细胞内游离Ca2+浓度(intracellular Ca2+concentration，[Ca2+]i)。本研究通过原代培养大鼠远端PASMC，选用SOCC 拮抗剂SKF96365和氯化镍(NiCl2)，观察其对CPA诱导的PASMC [Ca2+]i改变的影响，为进一步研究缺氧引起的肺动脉收缩和血管重塑机制打下基础。

1 材料与方法

1.1材料 主要试剂：Ⅰ型胶原酶、NaCl、KCl、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、NaHCO3、CPA、SKF96365、NiCl2、葡萄糖、硝苯地平(美国Sigma)；Fura-2 AM(美国Invitrogen)；PBS、胎牛血清、DMEM培养基(美国Gibco)。仪器：倒置相差显微镜、体式显微镜、荧光显微镜(日本Nikon)；InCyte细胞内钙浓度检测系统(美国Intracellular Imaging)；双通道温度控制系统(美国Warner Instrument)；显微镊、显微剪(上海金钟)。

1.2方法

1.2.1大鼠远端PASMC的原代培养 参照文献[12-14]的方法，选取250～300 g雄性SD大鼠8只，2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸取心肺，体式显微镜下用显微镊、剪分离肺内肺动脉。剥除血管外膜组织，纵向剪开血管，棉签刮除内皮后置入3 mLⅠ型胶原酶消化液(1 800 U/mL)中，37 ℃消化20 min，弃上层液，加入10%胎牛血清的DMEM培养基15 mL，吹吸20次制成细胞悬液，以5×104/mL接种于6孔培养板，37 ℃、5% CO2培养箱培养，每2～3天常规换液。

1.2.2[Ca2+]i测定 参照文献[12,15-16]的方法，选取50%～60%融合细胞于37 ℃避光负载5 μmol/L的Fura-2 AM 1 h，固定细胞盖玻片于荧光显微镜观测盒内，按0.50～1.00 mL/min流速用Krebs液(118.00 mmol/L NaCl、4.70 mmol/L KCl、1.18 mmol/L KH2PO4、0.57 mmol/L MgSO4、2.50 mmol/L CaCl2、25.00 mmol/L NaHCO3和10.00 mmol/L葡萄糖)灌流孵育细胞15 min，以16%O2、5%CO2混合氮气持续平衡灌流液，用双通道温度控制系统控制观测盒温度37.00～37.20 ℃，打开荧光显微镜和InCyte细胞内钙离子浓度检测系统，实时记录数据。

1.2.3CPA对PASMC[Ca2+]i影响 分对照组和CPA组。对照组先用Krebs液孵育5 min，再用5 μmol/L硝苯地平无钙Krebs液(118.00 mmol/L NaCl、4.70 mmol/L KCl、1.18 mmol/L KH2PO4、0.57 mmol/L MgSO4、25.00 mmol/L NaHCO3和10.00 mmol/L葡萄糖)孵育10 min，用5.00 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min后，最后用Krebs液孵育10 min。CPA组先用Krebs液孵育5 min，再用10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平无钙Krebs液孵育10 min，用10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min，最后用Krebs液孵育10 min。

1.2.4SKF96365、NiCl2对CPA诱导的PASMC [Ca2+]i升高的影响 分对照组、SKF96365组和NiCl2组。Krebs液孵育各组细胞5 min，对照组以10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平无钙Krebs液孵育10 min，再用10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min；而SKF96365组和NiCl2组在相同时相的灌流液中分别加入50.00 μmol/L SKF96365和500.00 μmol/L NiCl2，其余处理与对照组相同，最后，各组以Krebs溶液孵育10 min。

1.2.5SKF96365、NiCl2对高钾引起的PASMC[Ca2+]i升高影响 分KCl组、SKF96365组和NiCl2组。Krebs液孵育各组细胞5 min，KCl组用高钾Krebs液(60.00 mmol/L KCl、60.00 mmol/L NaCl、1.18 mmol/L KH2PO4、0.57 mmol/L MgSO4、25.00 mmol/L NaHCO3、2.50 mmol/L CaCl2和10.00 mmol/L葡萄糖)孵育10 min，SKF96365组用50.00 μmol/L SKF96365高钾Krebs液孵育10 min，NiCl2组用500.00 μmol/L NiCl2高钾Krebs液孵育10 min，3组细胞分别用Krebs液孵育10 min。

2 结 果

2.1CPA对大鼠远端PASMC[Ca2+]i的影响 对照组[Ca2+]i随时间变化维持基线(图1A)。CPA组换10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平无钙Krebs液孵育后，[Ca2+]i呈小幅升高，持续5～10 min达基线水平(图1B)；再换10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平Krebs液恢复细胞外Ca2+到2.50 mmol/L后，[Ca2+]i迅速升高(图1B)。CPA组△[Ca2+]i峰值达(382.83±83.17)nmol/L，对照组仅(25.17±6.75)nmol/L,两组比较差异有统计学意义(n=8，P<0.05)(图1C)；再以Krebs液孵育，[Ca2+]i恢复基线，见图1B。

A、B:对照组、CPA组时间-[Ca2+]i曲线；C:两组△[Ca2+]i峰值；a：P<0.05，与对照组比较。

图1 CPA对大鼠远端PASMC[Ca2+]i的影响

2.2SKF96365、NiCl2对CPA诱导的PASMC [Ca2+]i升高的影响 以10.00 μmol/L CPA、5.00 μmol/L硝苯地平Krbs液孵育恢复细胞外Ca2+到2.50 mmol/L，对照组[Ca2+]i迅速显著升高(图2A)，同时期SKF96365组和NiCl2组[Ca2+]i均仅小幅升高(图2B、C)，△[Ca2+]i峰值分别仅为(94.17±44.47)、(96.67± 44.92)nmol/L(n=6，P<0.05)，而对照组△[Ca2+]i峰值高达(386.81±66.72)nmol/L，见图2D。

2.3SKF96365、NiCl2对高钾引起的大鼠远端PASMC的[Ca2+]i升高的影响 高钾Krebs液孵育KCl组后，[Ca2+]i迅速增高(图3A)，换Krebs液孵育后[Ca2+]i恢复基线；同时期SKF96365组和NiCl2组[Ca2+]i也均迅速增高(图3B、C)，△[Ca2+]i峰值分别达(136.33±48.16)、(136.83±62.81)nmol/L(n=6，P>0.05)，与KCl组(134.50±70.41)nmol/L比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3D。

A、B、C：对照组、SKF96365组、NiCl2组时间-[Ca2+]i曲线；D：3组△[Ca2+]i峰值；a：P<0.05，与对照组比较。

图2 SKF96365、NiCl2对CPA诱导的PASMC[Ca2+]i升高的影响

A、B、C：KCl组、SKF96365组、NiCl2组时间-[Ca2+]i曲线；D:3组△[Ca2+]i峰值。

图3 SKF96365、NiCl2对高钾引起的大鼠远端PASMC[Ca2+]i升高的影响

3 讨 论

急性缺氧性肺血管收缩反应和慢性缺氧性肺血管结构重塑是缺氧性肺动脉高压发生的主要机制，肺动脉平滑肌[Ca2+]i升高在肺血管收缩和结构重塑中发挥关键作用。前期研究证实，原代培养的大鼠远端PASMC具有电压依赖性钙通道(the voltage-dependent Ca2+channels,VDCC)，5.00 μmol/L硝苯地平能完全阻断PASMC的VDCC[12]。

CPA是平滑肌肌浆网一种特异性的Ca2+ATP酶阻断剂，能不可逆的抑制肌浆网Ca2+泵。当用5.00 μmol/L硝苯地平孵育大鼠远端PASMC而阻断VDCC后，再用无钙Krebs液孵育细胞，CPA能使PASMC [Ca2+]i小幅短暂升高，提示CPA抑制肌浆网Ca2+泵后，导致肌浆网中Ca2+释放，从而使PASMC [Ca2+]i升高；在VDCC被5.00 μmol/L硝苯地平完全阻断条件下，再恢复细胞外Ca2+到2.50 mmol/L，CPA导致[Ca2+]i迅速显著升高，而去除CPA则导致[Ca2+]i恢复基线，提示大鼠远端PASMC肌浆网Ca2+泵被CPA抑制后，Ca2+从肌浆网释放，可能激活SOCC，SOCC激活后，细胞外Ca2+通过SOCC内流增加，引起[Ca2+]i升高，这和国外学者报道结果一致[17]。

文献报道SOCC既能被有机拮抗剂如SKF96365抑制，也能被无机拮抗剂如La3+、Cd3+、Ni2+抑制[18-19]。本实验中，大鼠远端PASMC用5.00 μmol/L硝苯地平阻断VDCC并分别用50.00 μmol/L SKF-96365或500.00 μmol/L NiCl2干预后，恢复细胞外Ca2+到2.50 mmol/L时CPA引起的[Ca2+]i升高幅度均显著下降，表明SKF96365和Ni2+均能明显抑制CPA诱导的大鼠远端PASMC的[Ca2+]i升高，进一步提示CPA激活SOCC后，导致细胞外Ca2+内流。进一步的高钾实验观察到SKF96365和Ni2+对高钾Krebs溶液引起的大鼠远端PASMC的[Ca2+]i升高并无影响，表明SKF96365和Ni2+对大鼠远端PASMC的VDCC均无影响，能选择性作用于SOCC。

综上所述，CPA可以导致大鼠远端PASMC的[Ca2+]i升高，其机制可能与肌浆网Ca2+泵被CPA阻断后释放肌浆网内Ca2+，并激活SOCC诱发细胞外Ca2+经SOCC内流有关；SKF96365和NiCl2能够选择性作用于SOCC，并明显抑制SOCC活性，导致SOCC介导的Ca2+内流减弱，提示大鼠远端PASMC细胞外Ca2+通过SOCC内流在缺氧引起的肺动脉收缩反应和结构重塑过程中可能发挥作用。

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Effect of SKF96365 and NiCl2on cyclopiazonic acid induced intracellular calcium cation concentration increase in rat distal pulmonary arterial smooth muscle cells*

PengGongyong,HuJinxing,ZouYimin,PengFang,ZhouYumin,HuGuoping,ZhaoZhuxiang

(NationalClinicalResearchCenterforRespiratoryDisease,NationalKeyLaboratoryofRespiratoryDisease,GuangzhouInstituteofRespiratoryDiseases,FirstAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Objective To study the effect of SKF96365 and NiCl2on cyclopiazonic acid (CPA) induced intracellular calcium cation concentration ([Ca2+]i) change in rat distal pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMC).Methods The rat distal PASMC were isolated and cultured.The effects of CPA,SKF96365 and NiCl2on [Ca2+]iin PASMC were tested by fluorescence microscope and InCyte [Ca2+]imeasurement system.Results PASMC were incubated with Ca2+-free Krebs solution containing 5 μmol/L nifedipine,10 μmol/L CPA caused a small transient increase in [Ca2+]i;after restoration of extracellular Ca2+to 2.5 mmol/L,10 μmol/L CPA caused marked increases in [Ca2+]iin PASMC incubated with Krebs solution containing 5 μmol/L nifedipine.Both 50 μmol/L SKF96365 and 500 μmol/L NiCl2distinctly attenuated the increases in [Ca2+]icaused by 10 μmol/L CPA in PASMC.However,neither 50 μmol/L SKF96365 nor 500 μmol/L NiCl2affected the increases in [Ca2+]icaused by 60 mmol/L KCl in PASMC.Conclusion CPA induced increases in [Ca2+]imay related to Ca2+release from sarcoplasmic reticulum and the influx of Ca2+through store-operated Ca2+channels (SOCC) in rat distal PASMC.Both SKF96365 and NiCl2could selectively block SOCC and attenuated the influx of Ca2+through SOCC in PASMC.

cyclopiazonic acid;intracellular calcium cation concentration;pulmonary arterial smooth muscle cells;nifedipine;store-operated Ca2+channels;rat

著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.002

国家自然科学基金资助项目(81000020)；十二五国家科技支撑计划课题资助项目(2013BAI09B09)；广东省自然科学基金资助项目(2014A030313486)；广州市科技计划资助项目(1563000587)；羊城学者科研计划学术骨干资助项目(10A025G)；呼吸疾病国家重点实验室青年科学基金支持资助项目(11)。

彭公永(1976-)，副主任医师，硕士生导师，医学博士，从事肺血管疾病基础与临床研究。

R543.2

A

1671-8348(2015)11-1445-04

2014-07-08

2015-01-16)