升气壮阳膏方联合特异性免疫对哮喘小鼠气道炎症的影响*

江文文庄 森廖若莎许楷斯翁泽林许尤佳

（1.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510405；2.广东省中医院，广东 广州510120）

·研究报告·

升气壮阳膏方联合特异性免疫对哮喘小鼠气道炎症的影响*

江文文1庄 森1廖若莎2△许楷斯2翁泽林2许尤佳2

（1.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510405；2.广东省中医院，广东 广州510120）

目的观察中药膏方联合特异性免疫治疗（SIT）对小鼠支气管哮喘的治疗作用。方法将BALB/c小鼠按随机数字表法随机分为空白对照组、哮喘模型组、SIT组、SIT联合中药膏方组，采用卵清蛋白（OVA）腹腔注射及雾化激发构建支气管哮喘小鼠模型，给予SIT及中药膏方灌胃治疗，进行肺泡灌洗液细胞计数和分类，用ELISA法测定血清IgE、肺泡灌洗液IL-4、IFN-γ含量，用HE染色法检测小鼠肺组织病理学改变。结果SIT、中药膏方联合SIT治疗组小鼠肺组织炎症细胞浸润程度减轻，其中后者作用更显著，血清IgE水平较哮喘组下降（P＜0.05），中药膏方组联合SIT组较SIT下降显著；SIT、中药膏方联合SIT组在肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数及嗜酸性粒细胞总数均减少，BALF的IL-4下降、IFN-γ上升（P＜0.05），但两者间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论中药膏方联合特异性免疫治疗可以降低小鼠血清IgE水平，减轻肺部炎症细胞浸润程度。

膏方 支气管哮喘 特异性免疫治疗

特异性免疫治疗（SIT）是目前唯一针对哮喘病因的治疗，能够改善哮喘的自然病程［1］，而其全身性不良反应的发生和起效缓慢成为限制特异性免疫治疗发展的主要因素［2］。中医药治疗哮喘有着悠久的历史，疗效卓著。在前期研究中［3-4］，笔者尝试中医药联合SIT以期减少SIT不良反应的发生，临床取得满意效果。中药膏方是哮喘缓解期常用的治疗方法，笔者观察中药膏方联合SIT对哮喘小鼠的治疗作用，探索其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Balb/c小鼠，雌性，6～8周龄，体质量16～20 g，共20只，购于广东省实验动物中心，合格证号为44007200009645。

1.2 药物 升气壮阳膏方（白术80 g，补骨脂100 g，防风50 g，升麻30 g，太子参60 g，陈皮20 g，石菖蒲50 g，芒果核150 g，川续断100 g，甘草30 g）由广东省中医院中药房提供，最终浓度为4.8 mg/mL。

1.3 试剂与仪器 卵清蛋白（OVA）：美国Sigma公司，批号为A5503-1G。铝佐剂（Imject Alum）：美国Thermo公司，批号为7716。小鼠IgE ELISA试剂盒（Mouse IgE ELISA Kit 96T）：广州妙博生物技术有限公司，批号为70-E-EK2752。小鼠IL-4 ELISA试剂盒 （Mouse IL-4 ELISA Kit 96T）：广州妙博生物技术有限公司，批号为70-E-EK2042。小鼠IFN-γ ELISA试剂盒（Mouse IFN-γ ELISA Kit 96T）：广州妙博生物技术有限公司，批号为70-E-EK2802。超声雾化机：402型超声雾化器，上海合力医疗器械厂。

1.4 模型制备 造模方法参照文献报道［5］。致敏：采用OVA腹腔注射致敏；分别于第0、7、14日经小鼠腹腔注射200 μL浓度为0.1 mg/mL混合致敏液（0.1%OVA 100 μL，与等体积佐剂液态铝［（imject alum）混合］，对照组给予200 uL（PBS+铝佐剂）腹腔注射。激发：于第24、25、26日将小鼠置于一密闭容器中（20 cm×40 cm× 50 cm）中，以1%的OVA溶液10 mL雾化吸入，每日1次，在最后1次激发后48 h（第28日）处死小鼠，收集标本进行相关研究。

1.5 分组与方法 将20只Balb/c小鼠编号，再用随机数字表法随机抽取分为A组：空白对照组。B组：哮喘模型组。C组：SIT组。D组：SIT加中药膏方组，每组5只。C组、D组，于第14、16、18、20、22、24、26日，行SIT，尾跟部皮下注射OVA 1 mg，共7次，A、B组注射等体积磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。中药膏方：D组于第14～27日给药治疗，每日1次，共用药2周。予膏方以10.73 g/（kg·d）灌胃（开水冲溶，冷却至适宜温度，1 mL温水约溶解0.5 mL膏方），其余各组给予等体积PBS灌胃。

1.6 标本采集与检测 血清：于实验第28日将小鼠摘眼球取血，留取血清，-20℃保持检测细胞因子。肺泡灌洗：采用支气管肺泡灌洗术行小鼠肺泡灌洗［6］，气管内插管，PBS 0.8 mL，灌洗2次，灌洗液回收率≥80%，以1500 r/min将BALF离心心10 min，离心管底部出现乳白色细胞沉淀，取上清液用于细胞因子（IFN-γ、IL-4）检测，细胞沉淀经100 μL 0.9%氯化钠溶液重悬后涂片，风干后行刘氏染色，在光学显微镜下进行细胞分类，数200个细胞，求出百分比。用所得的细胞总数乘以百分比即各类细胞的绝对计数。肺病理：取肺组织，甲醛固定，常规取材、脱水、石蜡包埋、制备石蜡切片、HE染色，然后行病理检测。

1.7 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，对各组数据进行正态分布检验和方差齐性检验，若符合正态分布、方差齐，进行单因素方差分析；若不服从正态分布和 （或）方差不齐的资料，进行秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 中药膏方联合SIT对肺泡灌洗液BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞计数的影响 见表1。B组、C组和D组的细胞总数均高于A组，尤其B组的细胞总数显著增加；细胞分类方面，结果表明除了A组，其余3组的嗜酸性粒细胞总数均增加（均P＜0.05），其中C组和D组嗜酸性粒细胞均较B组下降，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组小鼠BALF中细胞的总数和嗜酸性粒细胞计数比较（×104/mL，±s）

表1 各组小鼠BALF中细胞的总数和嗜酸性粒细胞计数比较（×104/mL，±s）

与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05。下同。

组别 n 总细胞数 嗜酸性细胞数A组 5 1 . 8 ± 0 . 8 4 0 B组 5 1 1 . 2 ± 3 . 5 6*2 . 8 ± 1 . 3 0*C组 5 4 . 2 ± 1 . 4 8#1 . 4 ± 1 . 2#D组 5 4 . 8 ± 3 . 0 3#1 . 2 ± 0 . 4 5#

2.2 各组肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IFN-γ水平的比较 见表2。B组较A组IL-4明显升高，而IFN-γ显著降低；治疗组C组和D组较哮喘组IL-4下降，IFN-γ上升（均P＜0.05）；而C组和D组比较，差异没有统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组小鼠BALF中IL-4、IFN-γ水平和血清IgE水平比较（±s）

表2 各组小鼠BALF中IL-4、IFN-γ水平和血清IgE水平比较（±s）

组别n I g E（n g / m L）I L -4（p g / m L） I F N -γ（p g / m L）A组 5 8 9 . 2 1 ± 4 8 . 6 5 B组 5 7 5 6 . 2 6 ± 1 1 3 . 7 5*C组 5 2 8 8 . 0 9 ± 1 6 2 . 5 2#2 5 5 . 8 ± 1 0 6 . 3 4 3 5 3 . 0 4 ± 1 8 4 . 7 5 3 3 1 . 6 6 ± 1 7 5 5 . 8 9*1 1 2 . 6 2 ± 5 7 . 4 9*3 0 1 . 6 ± 1 7 7 . 3 8#2 0 8 . 9 1 ± 9 4 . 8 3#D组 5 1 5 9 . 0 1 ± 5 3 . 4 8##3 4 0 . 4 0 ± 3 2 2 . 5 1#1 7 7 . 0 4 ± 9 3 . 0 4#

2.3 各组血清IgE水平比较 见表2。B组、C组、D组小鼠肺泡灌洗液IgE的水平均高于对照组，其中C组、D组均低于B组，D组低于C组（均P＜0.05）。

2.4 各组肺病理比较 A组：小鼠支气管壁未见炎症细胞浸润，黏膜上皮细胞形态完好，未见平滑肌增生，管腔内未见分泌物。B组：小鼠支气管壁及周围组织见大量的炎性细胞浸润，以淋巴细胞、嗜酸性粒细胞为主，黏膜上皮细胞坏死脱落，部分可见黏液上皮化生，管腔内见黏液性分泌物存留；部分区域肺泡隔增宽，血管旁多量慢性炎症细胞浸润。C组：支气管壁及周围组织炎症细胞较模型组减少，上皮细胞受损减轻，管腔内分泌物减少。D组：肺泡壁毛细血管扩张、充血程度较模型组减轻，支气管上皮结构完整，腔内无明显分泌物，气道平滑肌层稍增生，厚度比SIT组稍薄，肺泡间隔窄，肺泡腔内透亮，无明显炎性渗出。

图1 各组小鼠肺组织病理表现（HE，×20）

3 讨 论

SIT能够改善哮喘症状，可减少哮喘症状评分、药物需求，减轻气道高反应性［7］，SIT通过干预哮喘的病理生理机制而从根本上改变疾病的自然进程。SIT可作为一种单独的治疗方法，但对于需要适度药物治疗的患者，联合免疫治疗可取得最大的益处［8］。而SIT由于治疗周期长，起效慢，费用高，存在不良反应风险［9］，因此治疗的普及和推广受到限制。而联合中医药治疗，可与SIT取长补短，缩短起效时间，提高疗效，减少不良反应的发生率，但是其具体机理尚未明确。

本研究利用OVA诱导和激发复制哮喘小鼠模型，并给以SIT治疗和中药膏方联合SIT治疗。研究结果表明，SIT治疗组和中药膏方联合SIT组均可使小鼠的BAFL的细胞总数和嗜酸性粒细胞总数下降，肺组织病理的炎症浸润情况较哮喘组轻，BAFL中IL-4下降，IFN-γ上升，提示SIT可能通过上调Th1细胞功能和下调Th2细胞功能的作用，从而调节了Th1/Th2的失衡，与之前的文献报道符合［10-11］；而血清IgE方面，中药膏方联合SIT组低于单纯SIT组，但是两组在IL-4、IFN-γ差异上均无统计学意义，结合病理结果，中药膏方联合SIT组在肺脏炎症细胞浸润程度较SIT组轻，提示中药膏方可能通过其他途径降低血清IgE水平，减轻局部炎症细胞浸润，而其机制有待于进一步的研究。升气壮阳膏方由白术、补骨脂、防风、升麻、太子参、陈皮、石菖蒲、芒果核、续断、甘草等药物组成，其中补骨脂、续断补肾助阳，白术、太子参健脾益气，升麻可扶助提升阳气，防风可升脾之清阳，陈皮、芒果核、石菖蒲可理气化湿，甘草调和诸药，全方共奏温肾健脾、升阳降浊之功［12］。

目前关于SIT治疗的机制存在多种解释，有研究指出［13］，SIT的主要作用机制就是诱导调节性T细胞（Treg细胞）形成，IL-10、TGF-B产物增加，可诱导T调节性亚群和T细胞耐受现象。亦有研究者指出［14-15］，T细胞无能可能是哮喘SIT的作用机制之一；目前中药膏方联合SIT的研究较少［16-17］，但是其疗效已经在临床上得到验证，有必要开展进一步研究探索其作用机制。

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The Effects of Shengqi Zhuangyang Medicinal Extract Combined with Specific Immunotherapy on Airway Inflammation of Mouse with Bronchial Asthma

JIANG Wenwen，ZHUANG Sen，LIAO Ruosha，et al. The Second School of Clinic Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong，Guangzhou 510405，China

Objective：To observe the effects of Shengqi Zhuangyang medicinal extract combined with specific immunotherapy on airway inflammation of mouse with bronchial asthma，and to explore its mechanism in treating asthma.Methods：Twenty BALB/c mice were randomly divided into the blank control group，the asthma group，the SIT group and the SIT+medicinal extract group.Asthma was induced by intraperitoneal injection of ovalbumin（OVA）and forced inhalation of atomized OVA.The numbers of the total inflammation cells and esoinophils（EOS）in BALF were counted by alveolar wash.IL-4，IFN-γin BALF and IgE in blood were analyzed by ELISA. Pathological changes of the lung tissues were observed by HE straining.Results：After the therapy，the lung inflammation was reduced，and the IgE level in blood was lowered，especially in the SIT+medicinal extract group，and the numbers of total cells and EOS decreased.IFN-γ level was raised and IL-4 level was lowered in BALF，which had no differences between the SIT group and the SIT+medicinal extract group.Conclusion：Shengqi Zhuangyang medicinal extract combined with specific immunotherapy can reduce the inflammation of lung and lower IgE level in blood

Medicinal extract；Asthma；Specific immunotherapy

R285.5

A

1004-745X（2015）08-1324-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.004

2015-04-11）

广东省科技计划项目（No.2012B031800190）；广东省中医院中医药科学技术研究专项资助（No.YK2013B2N18）

△通信作者（电子邮箱：chindhd2002444＠sina.com）