溃疡性结肠炎（脾肾阳虚证）大鼠模型的实验研究*

王燚霈 朱 莹王 璇

（湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

·研究报告·

溃疡性结肠炎（脾肾阳虚证）大鼠模型的实验研究*

王燚霈 朱 莹△王 璇

（湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

目的研制与临床证候相吻合的切实可行的溃疡性结肠炎（脾肾阳虚证）的大鼠模型。方法将SD实验大鼠按随机数字表法随机分为4组：正常对照组、脾肾阳虚组、溃疡性结肠炎组（溃结组）、脾肾阳虚溃结组（病证结合组），正常对照组无任何干预措施；脾肾阳虚组先以番泻叶灌胃，然后用冰水湿润皮毛后再用电风扇将其皮毛吹干；溃结组以三硝基苯磺酸钠（TNBS）灌肠；病证结合组先以脾肾阳虚组的方法处理，连续处理4周后，再予TNBS灌肠。观察大鼠一般症状体征、中医证候、结肠组织的改变、血清大鼠游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、大鼠游离四碘甲状腺原氨酸（FT4）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等指标。结果病证结合组、脾肾阳虚组大鼠的中医证候评分、血清FT3、FT4、SOD、MDA等指标与正常对照组、溃结组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；病证结合组、溃结组结肠肉眼观及结肠黏膜损伤程度与正常对照组、脾肾阳虚组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论先以番泻叶灌胃及冰水湿身风干法处理大鼠，再用TNBS灌肠，从而研制出的溃疡性结肠炎（脾肾阳虚证）大鼠模型，对临床有实践意义。

溃疡性结肠炎 脾肾阳虚证 病证结合 动物模型 大鼠

溃疡性结肠炎（UC）的病因尚不十分清楚，在我国发病率逐年增高［1］。为了更好地阐明该病的病因病机、发展规律及理想的防治，建立理想的动物模型具有重要的意义。笔者在近10年的临床研究中发现，大多UC患者临床表现以脾肾阳虚的症状为主，目前临床上对于溃疡性结肠炎动物模型的研究多种多样，但未见有契合脾肾阳虚证的动物模型。为此，本研究前期进行了脾肾阳虚证溃结大鼠的研制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雌雄各半SD大鼠40只，体质量（200±20）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 试剂与仪器 大鼠游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、大鼠游离四碘甲状腺原氨酸（FT4）测定试剂盒，购于上海通蔚生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒购于北京博迈斯科技发展有限公司。全自动图像数字化分析仪、微循环显微镜（上海徕卡显微镜公司生产，湖南中医药大学第二附属医院病理科及皮肤病研究实验室提供）。

1.3 动物分组 选用健康成年SD雌雄各半大白鼠40只，随机数字表法随机分为4组：正常对照组、脾肾阳虚组、溃疡性结肠炎组（溃结组）、脾肾阳虚溃结组（病证结合组），每组各10只。

1.4 模型制备 正常对照组无任何干预措施。溃结组：参照文献［2-3］，使用三硝基苯磺酸（TNBS）诱导法：将大鼠禁食12 h，10%水合氯醛以4 mL/kg进行腹腔注射，后将一长约12 cm直径2 mm的橡胶输液管用石蜡油润滑后缓慢插入肛门深约8 cm，将0.5 mL的三硝基苯磺酸乙醇溶液以100 mg/kg的比例注入肛管，造成溃结模型，3周后采集标本观察。脾肾阳虚组参考文献［4-5］，用自制的浓度为100%的番泻叶药液给大鼠灌胃，每日1次，每只3 mL，30 min后向每只大鼠均匀喷洒60 mL 3℃的冰水，将全身皮毛打湿，然后再把大鼠置于1400r/min的电风扇前将其毛发吹干，连续处理4周。症证结合组综合溃结组和脾肾阳虚组的方法，即先以100%番泻叶灌胃，冰水喷湿全身皮毛后再用电风扇吹干，连续处理4周后，再予TNBS灌肠，3周后采集标本观察。

1.5 标本采集与处理 1）于造模后称大鼠体质量，脱颈椎全部处死，自距肛门约2 cm处向上剖取结肠8 cm左右，将取出结肠组织剖开、展平，肉眼观察结肠黏膜形态，并做组织损伤评分比较。2）用10%乌拉坦将大鼠麻醉，置于实验台，分离大鼠颈动脉，插管并结扎，松开血管夹，采集管采集血液，将采集管放入离心机，3500 r/min离心15 min，取上清液放置于4℃冰箱，检测FT3、FT4、SOD、MDA等生化指标。

1.6 观察指标 1）观察大鼠中医证候的变化。中医证候诊断标准参照 《中药新药临床研究指导原则 （试行）》［6］及参考文献［7-8］拟定。主证：大便溏泄；食少。兼证：体质量减轻甚则消瘦；精神萎靡，毛色无光泽；蜷缩扎堆；容易疲劳。具备2项主症及兼症中2项即可认为符合中医证候诊断。2）疾病活动指数（DAI）。每日记录大鼠的粪便性状、便血情况、体质量、体温等情况，进行疾病活动指数（DAI）［9-10］评分。3）结肠黏膜损伤指数（CMDI）。大鼠剖腹后立即进行肉眼大体结肠黏膜，用放大镜观察肠黏膜有无充血水肿、糜烂及溃疡形成［12-13］，进行结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分［14-15］。4）血清FT3、FT4、SOD、MDA等指标。FT3、FT4使用放免法检测；SOD、MDA使用分光光度计法检测。

表1 疾病活动指数（DAI）的评估指标

表2 肉眼观察结肠形态和黏膜损伤评分标准

1.7 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，先进行正态性检验，先进行正态性检验，符合正态性用t检验，不符合正态性用非参数（秩和）检验；计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验，等级资料采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠中医证候比较 正常对照组：第1～3周大鼠精神状态良好，反应敏锐，毛色光亮有泽，每1周体质量增加约40 g，大便硬。溃结组：第1～3周大鼠体质量稍有减轻，由180～220 g下降到160～200 g，无消瘦，稀便甚或脓血便，进食可，神态尚可，毛色稍无华，无蜷缩聚堆，活动尚灵敏，本组不具备2项主证及2项兼证，不符合中医证候诊断标准。脾肾阳虚组：第1～3周逐渐出现大便溏泄，食少，蜷缩聚堆，易疲劳症状，体质量无明显变化，具有主证2项及兼证2项，符合中医证候诊断标准。病证结合组：灌肠后第1日出现懒动，厌食，稀便，第1～3周逐渐出现蜷缩聚堆，体质量减轻，由180～220 g下降到155～195 g，消瘦，神态萎靡，毛色暗淡无华，解稀便脓血便，与所有主证及兼证一致，符合中医证候诊断标准。

2.2 各组疾病活动指数（DAI）评分比较 每天记录大鼠大便性状、便血、体质量、体温等一般临床表现，进行疾病活动指数（DAI）评分。通过体质量下降、粪便性状、便血积分及体温对各组进行比较，结果见表3，各组3项积分与正常对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0．05）；溃结组与病证结合组比较，体质量下降、大便性质、便血积分差异均无统计学意义（P＞0．05）。体温方面，正常对照组与溃结组、脾肾阳虚组与病证结合组之间，差异无统计学意义（P＞0．05），后两组大鼠体温均显著低于前两组（P＜0．05），提示番泻叶苦寒泻下，极易损失体内阳气，再以冰水喷施皮毛和吹风处理，对机体阳气更易损伤。

表3 各组大鼠DAI比较（±s）

表3 各组大鼠DAI比较（±s）

与正常对照组比较，*P＜0.05；与病证结合组比较，△P＜0.05；与脾肾阳虚组比较，▲P＜0.05。下同。

组别 n 体质量下降（分） 体温（℃）大便性状（分） 便血（分）正常对照组 1 0溃结组 1 0脾肾阳虚组 1 0 3 6 . 4 1 ± 0 . 9 6△1 . 9 8 ± 0 . 1 9*▲3 6 . 2 7 ± 0 . 8 3△0 . 1 2 ± 0 . 1 6*3 5 . 1 3 ± 0 . 7 7*0 0 0 3 . 8 9 ± 0 . 2 3*▲3 . 1 2 ± 0 . 1 8*▲2 . 6 7 ± 0 . 2 4*0病证结合组 1 0 2 . 0 6 ± 0 . 2 0*▲3 4 . 9 8 ± 0 . 6 9*4 . 0 5 ± 0 . 1 9*▲3 . 0 7 ± 0 . 2 2*▲

2.3 各组结肠黏膜损伤指数（CMDI）比较 见表4。造模完成后，结肠黏膜肉眼大体观察，正常对照组大鼠肠黏膜皱襞血管纹理清晰，没有明显的糜烂和溃疡，整个肠段平均长度在18 cm以上；溃结组、病证结合组两组大鼠可见不同程度的肠壁增厚粘连，糜烂和溃疡表面附着有黑黄相兼样物质，周围黏膜充血水肿明显，整个肠段长度缩短，平均长度在15 cm左右；脾肾阳虚组大鼠结肠黏膜见轻度充血，无炎症及溃疡形成。

表4 各组大鼠CMDI评分比较（分，±s）

表4 各组大鼠CMDI评分比较（分，±s）

组别 n 结肠形态 结肠黏膜正常对照组 1 0 0 0溃结组 1 0 1 . 4 9 ± 0 . 2 3*4 . 3 7 ± 0 . 3 1*脾肾阳虚组 1 0 0 . 0 5 ± 0 . 1 4 0 . 5 6 ± 0 . 2 4病证结合组 1 0 1 . 6 3 ± 0 . 1 9*4 . 5 2 ± 0 . 2 8*

2.4 各组大鼠血清FT3、FT4、SOD、MDA等检测指标比较 见表5。FT3、FT4使用放免法检测；SOD、MDA使用分光光度计法检测。血清FT3、FT4：脾肾阳虚组和病证结合组均显著低于正常对照组和溃结组 （P＜0.01）。血清SOD、MDA：正常对照组、溃结组血清SOD显著高于脾肾阳虚组、病证结合组 （P＜0.01），血清MDA则显著降低（P＜0.01）。

3 讨 论

历代医家认为UC的发病，湿热为其主要原因，但本课题组一直致力于中医药防治溃疡性结肠炎的基础与临床研究，近10年的前期研究发现大多UC患者表现为脾肾阳虚的症状为主，实为病延日久，损伤肾阳，命门火衰，无力温煦脾土，最终导致脾肾阳虚。已有研究者对溃疡性结肠炎的动物模型进行过研究［16］，也有学者对脾肾阳虛证模型进行研究［5，17-18］，但将两者结合起来的UC脾肾阳虛模型的制作方法尚未见相关报道，因此研制该病证动物模型对于加深对其病理本质的认识及开创新的治疗方法显得尤为重要。

表5 各组大鼠FT3、FT4、SOD、MDA比较（±s）

表5 各组大鼠FT3、FT4、SOD、MDA比较（±s）

与正常对照组、溃结组比较，**P＜0.01。

组别 n F T 3（f m o l / m L）F T 4（f m o l / m L） S O D（N U / m L）M D A（n m o l / m L）正常对照组 1 0溃结组 1 0脾肾阳虚组 1 0 8 . 7 6 ± 0 . 3 4 8 . 3 5 ± 0 . 4 6 6 . 0 6 ± 0 . 6 5*1 1 . 6 8 ± 0 . 2 2 1 7 6 . 3 6 ± 5 . 3 1 1 1 . 3 0 ± 0 . 5 6 1 7 4 . 1 2 ± 8 . 7 2 8 . 7 9 ± 0 . 3 5*1 5 9 . 3 2 ± 6 . 5 5*0 . 2 0 ± 0 . 0 5 0 . 2 2 ± 0 . 0 6 0 . 3 4 ± 0 . 0 4*病证结合组 1 0 5 . 9 0 ± 0 . 4 6*8 . 3 3 ± 0 . 6 8*1 5 7 . 4 4 ± 9 . 2 1*0 . 3 5 ± 0 . 0 9*

目前动物实验中主要通过观察动物的症状，结合《中医虚证辨证参考标准》［7］，来判断肾阳虚模型是否成功。肾阳虛模型常会出现毛发稀疏、暗淡无光泽，进食饮水减少，反应变慢，蜷缩扎堆，消瘦，畏寒、体温下降，活动减少等症状。其他生化指标主要涉及下丘脑-垂体轴、甲状腺、生殖系统、肾以及一些其他的血液指标、免疫功能等，如常伴有血清FT3、FT4含量明显下降［19-20］，MDA含量增高、SOD降低［21-22］。脾阳虛证动物模型的表现大多与肾阳虛证相类似：体质量下降，体温降低，食欲减退，倦怠乏力，嗜卧扎堆，大便溏泄，毛色无光，个别动物肛门脱垂，甚则死亡［23］；生化指标有：脾细胞膜蛋白激酶C（PKC）活性明显降低、胞浆PKC活性明显增高［24］，血清SOD活性降低［25］，MDA含量增高［26］，结合脾阳虚及肾阳虚症状及生化指标，可以得出脾肾阳虚证会有体温下降，SOD活性降低，MDA含量增高。

从本实验结果可以看出，脾肾阳虚组及病证结合组大鼠体温、SOD活性显著低于正常对照组及溃结组，血清MDA含量显著升高，结果符合脾肾阳虚型会出现的症状及生化指标的变化。

综上所述，番泻叶灌胃及冰水湿身风干法造成的脾肾阳虚型大鼠，再用TNBS灌肠，从而研制出的脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠模型，对临床有实践意义。

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Experimental Research of Rat Model with Ulcerative Colitis of Spleen-kidney Yang Deficiency Type

WANG Yipei，ZHU Ying，WANG Xuan. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410005，China

Objective：To investigate establishment of the rat model with ulcerative colitis of Spleen-kidney yang deficiency type based on ulcerative colitis model.Methods：A11 the SD rats were divided randomly into 4 groups，namely the normal control（NC），the Spleen-kidney Yang Deficiency（SKYD），the ulcerative colitis（UC），and the SKYD with ulcerative colitis（SKYDUC）.The rats in NC group had no intervention measures，in UC clystered by TNBS，in SKYD gavaged with folium sennae solution and washed with ice water，then dried their furs with electric fan，and in SKYDUC managed firstly with the same method as SKYD for four weeks，then clystered by TNBS.The following items were observed：the general symptoms and signs，the changes of syndrome of traditional Chinese medicine，colon tissue and serum indicators such as FT3，FT4，MDA，SOD.Results：Compared with the NC and UC group，the differences of the TCM syndrome score，serum FT3，FT4，SOD and MDA in the SKYDUC and SKYD group were statistically significant（P＜0.05）.Compared with the NC and SKYD group，the difference of eye view of colon and colonic mucosa damage in SKYDUC and UC group was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：The method used to induce the model in SKYDCB is feasible in practice.

Ulcerative colitis；Spleen-kidney Yang Deficiency；Combination of disease and syndrome；Animal model；Rats

R285.5

A

1004-745X（2015）08-1332-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.007

2015-03-20）

湖南省教育厅重点项目（13A069）；湖南省科技厅一般项目（2013SK3080）

△通信作者（电子邮箱：zhuying089＠126.com）