维A酸软膏中维A酸的含量测定及有关物质的检查

蔡 乐，姚 兰，白 林（解放军总医院药品保障中心，北京 100853）

·实验研究·

维A酸软膏中维A酸的含量测定及有关物质的检查

蔡 乐，姚 兰，白 林（解放军总医院药品保障中心，北京 100853）

目的：建立维A酸软膏中维A酸的含量测定及有关物质检查的方法。方法：采用HPLC法测定维A酸的含量。色谱柱：Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-2%冰醋酸（85 : 15），流速：1.0 mL·min-1，检测波长：354 nm，柱温：45 ℃。结果：维A酸与其他杂质分离良好，与异维A酸的分离度＞ 5。维A酸在0.934 4 ～ 18.687 2 μg·mL-1范围内线性关系良好（r = 1.000 0）；维A酸的平均回收率为99.4%（RSD = 1.44%，n = 9）。结论：采用该方法测定维A酸软膏中维A酸的含量操作简单，结果准确，可作为该制剂的质量控制方法。

高效液相色谱法；维A酸软膏；含量测定；维A酸；异维A酸

维A酸软膏收载于《中国人民解放军医疗机构制剂规范》（2002年版）[1]，由维A酸、凡士林和液体石蜡组成，其中维A酸是维生素A的活性代谢产物，具有促进表皮细胞更新、调节表皮细胞增殖和分化作用，该药常用于各种类型的扁平苔藓、毛囊角化病、痤疮及其他角化异常类皮肤病的治疗。在《中国人民解放军医疗机构制剂规范》（2002年版）中并未记载维A酸软膏的含量测定方法，维A酸不稳定见光易转化为其顺势异构体异维A酸，为提高维A酸软膏的质量标准，更好地控制该制剂的质量，提高临床用药的安全性和有效性，本研究建立了测定维A酸软膏中维A酸的含量及检查有关物质异维A酸的HPLC方法。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪（包括1200系列在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、VWD检测器和色谱工作站，美国Agilent公司）；AG-285型电子天平（瑞士Mettler公司）；UV-2550型紫外分光光度仪（日本岛津公司）。

维A酸对照品（中国食品药品检定研究院，纯度99.4%，批号100224-200903）；异维A酸对照品（中国食品药品检定研究院，纯度99.8%，批号100224-200903）；维A酸软膏（本院自制，规格：0.025%、20 g/盒，批号20140120-1、20140120-2、20140121）；甲醇为色谱纯；乙醇、冰醋酸为分析纯；水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-2%冰醋酸（85 : 15）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：354 nm；柱温：45 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液 精密称定维A酸对照品9.4 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为维A酸对照品储备液。精密称定异维A酸对照品12.3 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为异维A酸对照品储备液A。精密量取异维A酸对照品储备液A 1 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为异维A酸对照品储备液B。精密量取维A酸对照品储备液2.5 mL和异维A酸对照品储备液B 4 mL，置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（含维A酸2.335 9 μg·mL-1和异维A酸0.491 0 μg·mL-1）。

2.2.2供试品溶液 避光操作，取供试品约1.0 g（含维A酸约0.25 mg），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇50 mL，称定重量，于60 ℃水浴中充分振摇15 min，再置于冰浴中冷却2 h。取出后用无水乙醇补足重量，迅速滤过，放至室温后，取续滤液5 mL置10 mL棕色量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液 另按处方比例及制备工艺，取除维A酸以外的其余成分，配制不含维A酸的空白制剂，依供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 系统适用性实验

分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液按“2.1”项下色谱条件，各进样10 μL，测定HPLC图谱，考察供试品中维A酸、异维A酸和其他组分色谱峰分离情况。在此色谱条件下，维A酸的保留时间为18.4 min，异维A酸的保留时间为16.3 min，维A酸和异维A酸色谱峰峰形对称尖锐，分离度大于5，基线平稳，与其他色谱峰分离良好，阴性对照无干扰，见图1。

2.4 线性关系考察

精密量取维A酸储备液适量，加流动相配制成含维A酸分别为0.934 4、2.335 9、4.671 8、9.343 6、14.015 4、18.687 2 μg·mL-1的标准溶液。分别精密吸取标准溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以峰面积值为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，计算得维A酸的回归方程为Y = 89.383 X + 1.874 2，r = 1.000 0。结果表明，维A酸在0.934 4 ～18.687 2 µg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

图1 维A酸软膏的HPLC色谱图A – 阴性对照，B – 对照品，C – 供试品；1 – 异维A酸，2 – 维A酸Fig 1 HPLC chromatogram of tretinoin ointmentA – negative reference substance, B – reference substance, C – sample; 1 – isotretinoin, 2 – tretinoin

2.5 精密度实验

取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次测定，计算维A酸的峰面积RSD为0.06%（n = 6），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

取同一供试品（批号20140120-1）约1.0 g，共6份，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算含量RSD为1.73%（n = 6），表明方法重复性良好。

2.7 回收率实验

取“2.2.3”项下空白制剂9份，分成3组，每组3份，每份约1.0 g。分别精密加入一定量的维A酸对照品储备液，于50 ℃微温下与空白制剂混合，再按供试品溶液制备方法制成含量约为供试品标示量的80%、100%、120%的样品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。

表1 维A酸软膏回收率实验测定结果.n= 9Tab 1 Results of recovery test about tretinoin ointment.n= 9

2.8 样品含量测定

取3批样品（批号20140120-1、20140120-2、20140121），每批3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以外标法计算各个样品中维A酸的含量，结果见表2。

表2 维A酸软膏中维A酸的含量.n= 3Tab 2 Determination of contents of tretinoin in tretinoin ointment.n= 3

2.9 异维A酸限量检查

取3批样品（批号20140120-1、20140120-2、20140121），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依照“2.1”项下色谱条件，40 μL进样测定。供试品溶液色谱图中若有与异维A酸保留时间一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照品溶液10 μL进样时异维A酸峰面积的5%。经测定，3批样品异维A酸的限量均符合规定。

3 讨论

3.1 维A酸含量测定方法的选择

维A酸的含量测定方法主要有UV法[2-3]和HPLC法[4-6]。经实验发现，维A酸软膏中凡士林等基质和异维A酸等杂质在维A酸最大吸收波长处均有吸收，对紫外分光光度法测定存在影响，采用HPLC法则可避免基质和杂质对维A酸测定的干扰，并可对制剂中的杂质进行限量检查。由于软膏基质黏度大，成分复杂，处理不当易造成色谱柱堵塞。因此，本实验在参考文献基础上，对提取条件等进行了优化。

3.2 色谱条件的选择

研究中曾参考文献[6]维A酸原料药含量测定项下的流动相甲醇-2%冰醋酸（81 : 19）进行实验，但采用该配比测定时维A酸的出峰时间偏长（约30 min），且峰形宽。经实验发现维A酸对甲醇的比例变化敏感，维A酸在甲醇-2%冰醋酸（90∶10）的条件下，出峰时间可缩短为10 min左右，但维A酸与异维A酸的分离度 ＜ 5；而维A酸在甲醇-2%冰醋酸（85∶15）的条件下，出峰时间为18 min左右，维A酸与异维A酸的分离良好（分离度 ＞ 5），为此确定流动相为甲醇-2%冰醋酸（85∶15）。通过扫描维A酸标准溶液的紫外图谱，发现维A酸在354 nm处有最大吸收，因此选择354 nm为检测波长。

3.3 提取条件的选择

本研究分别以无水乙醇、甲醇和流动相作为溶剂提取样品，发现无水乙醇的提取率明显高于甲醇和流动相。为减小供试品溶液对色谱柱的损坏，使用无水乙醇提取后，可冰浴2 h使软膏基质沉淀，滤过后再用流动相稀释进一步析出杂质，最后用0.22 μm微孔滤膜滤过后进样[7]。此外，对提取时间和温度进行优化，发现60 ℃水浴时充分振摇15 min即可完全提取样品。

3.4 维A酸的稳定性

本研究考察了光线对维A酸稳定性的影响。实验结果表明，维A酸溶液在室温光照条件下极不稳定，1 h含量下降近20%，8 h含量下降超过60%；而维A酸在室温避光条件下，12 h基本稳定，因此实验操作中要注意严格避光。

由于维A酸不稳定，见光易转化为异维A酸，而异维A酸具有较强的致畸作用，因此应对制剂中异维A酸的含量进行限制。参考文献[6]维A酸乳膏中的检查方法，本研究将供试品40 μL进样中异维A酸峰面积限定为不大于对照品溶液（10 μL进样）中异维A酸峰面积的5%，经检查所配制的3批样品均符合规定。

综上，采用HPLC法操作简便，准确性高，重复性好，可作为维A酸软膏中维A酸含量测定及有关物质检查的方法。

[1] 中国人民解放军总后勤卫生部.中国人民解放军医疗机构制剂规范（2002年版）[S].北京：人民军医出版社，2003：166.

[2] 姜武民，黄波.维A酸乳膏(0.025%)含量测定方法的探究[J].实用药物与临床，2011，14（3）：229-230.

[3] 吴畏，陈雅，杨征，等.紫外分光光度法测定维 A 酸软膏的含量[J].中国药业，2012，21（2）：36-37.

[4] 王福霞，冯文菊，姜武民.HPLC法测定维A酸与异维A酸含量[J].药物分析杂志，2007，27（4）：585-587.

[5] 魏立明，宋霞，宋三孔，等.HPLC双波长法同时测定复方维A酸软膏中2主药的含量[J].中国药房，2012，23（8）：737-739.

[6] 国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）[S]. 2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：893-894.

[7] 蔡乐，白林，徐风华，等.HPLC法测定薄荷苯酚软膏中苯酚的含量[J].中国药物应用与监测，2014，11（2）：82-84.

Determination of tretinoin and its related substance in tretinoin ointment

CAI Le, YAO Lan, BAI Lin(Department of Pharmaceutical Care, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective:To establish the HPLC method for determination of tretinoin and its related substance in tretinoin ointment.Methods:HPLC analysis was carried out on a column of Agilent Zorbax SB C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with mobile phase consisted of methanol -2% glacial acetic acid solution (85 : 15), the flow rate was 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was set at 354 nm and column temperature was 45 ℃.Results:The separation between tretinoin and other impurities was well under this chromatographic condition, and separating degree of tretinoin and isotretinoin was ＞ 5. The calibration curve of tretinoin was linear in the ranger of 0.934 4 – 18.687 2 μg·mL-1(r = 1.000 0). The average recovery of tretinoin was 99.4% (RSD = 1.44%, n = 9).Conclusion:This method is simple, accurate and feasible, which can be applied as the quantitative method for the determination of tretinoin in tretinoin ointment.

HPLC; Tretinoin ointment; Content determination; Tretinoin; Isotretinoin

R917

A

1672 – 8157(2015)03 – 0144 – 03

2014-09-08

2015-01-20）

军队医疗机构制剂标准提高科研专项重点课题：半固体制剂标准提高系列研究（13ZJZ05）

白林，女，主任药师，研究方向：药物分析、医院药学。E-mail：bailin301@126.com

蔡乐，男，主管药师，主要从事药物分析、医院药学工作。E-mail：caile15009@163.com