气相色谱/三重四极杆串联质谱法测定牛奶及奶粉中213种农药多残留

王 敬, 艾连峰*, 马育松, 张海超, 李 玮, 于 猛

(1. 河北出入境检验检疫局, 河北 石家庄 050051; 2. 河北农业大学食品科技学院, 河北 保定 071000)

研究论文

气相色谱/三重四极杆串联质谱法测定牛奶及奶粉中213种农药多残留

王 敬1, 艾连峰1*, 马育松1, 张海超1, 李 玮1, 于 猛2

(1. 河北出入境检验检疫局, 河北 石家庄 050051; 2. 河北农业大学食品科技学院, 河北 保定 071000)

在系统优化固相萃取吸附剂填料类型、洗脱溶剂种类及体积的基础上,建立了牛奶和奶粉中213种农药残留的气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)方法。试样用乙腈均质提取,采用石墨化炭黑/氨基柱(ENVI-Carb/NH2)净化后,用GC-MS/MS多反应离子监测(MRM)模式进行检测,外标法定量。结果表明,197种农药在10～1 000 μg/L，16种农药在50～1 000 μg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.99,方法的检出限(S/N=3)为0.03～7.59 μg/kg,定量限(S/N=10)为0.10～21.94 μg/kg,平均添加回收率为66.9%～120.1%,相对标准偏差(RSD)为1.23%～17.6%。该方法样品处理简单快速,相比其他多残留分析方法净化效果好,灵敏度和选择性高,适用于日常检测工作。

气相色谱-三重四极杆串联质谱;农药残留;牛奶;奶粉

三聚氰胺事件后,乳品安全问题从未远离公众视野;肉毒杆菌污染、多美滋奶粉硝酸盐含量超标等各类“奶粉门”事件层出不穷,甚至母乳中检出农药残留,各种农药、兽药、激素等药品的超标、违规使用,正成为乳品质量安全的源头之祸[1-3]。研究表明,奶中农药残留污染对人体健康的危害属于长时期、微剂量及慢性细微毒性效应。这种毒性效应起病缓慢、持续期长、涉及面广、影响人数多,可以在人体生理、自身免疫功能、致癌、致畸及致突变等方面反映出来[3]。在世界经济一体化趋势不断加快的今天,发达国家竖起的“技术壁垒”日益强化,作为乳及乳制品的进出口大国,我国的乳品屡遭质疑。各国政府不断修订了乳及乳制品中农药最高残留限量,新修订的标准越来越严,限量越来越低,且大多数国家及地区对杀虫剂、除草剂和杀菌剂3类农药都进行了较多的限定[4]。日本共制订了300多种农药在奶中的农药残留最大限量值,且大多数农药已达到了“一律不准”,其中杀扑磷更是低至0.001 mg/kg; 2014年8月1日实施的中国香港《食物内除害剂残余规例》制订了牛奶中142种农药残留限量,其中杀扑磷低至0.001 mg/kg,七氯为0.006 mg/kg,异狄氏剂为0.000 8 mg/kg,嘧菌环胺更是低至0.000 4 mg/kg;欧盟共制订了460多种农药在奶中的最大残留限量值,其中林丹低至0.001 mg/kg;美国共制订了牛奶中190余种农药的最大残留限量,其中乐果低至0.002 mg/kg;澳大利亚共制订了牛奶中227种农药的最大残留限量,其中醚菌酯低至0.001 mg/kg。其中,欧盟、日本和澳大利亚在乳及乳制品中农药残留方面的规定最严格,限定的种类最多。我国2014年8月1日实施的GB 2763-2014《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[5]则仅仅规定了奶类中狄氏剂的限量为0.006 mg/kg。无论是农药品种,还是农药残留指标数都远远低于发达国家和国际组织,使我国的乳品安全问题存在隐患。

乳及乳制品的脂肪含量高,基质较为复杂,且农药含量极低,对于农药残留分析是一个极大的挑战。目前,国内外的研究范围大多数还停留在检测一类农药品种水平,对于同时测定不同种类农药的报道较少[6-15]。郑军红等[2]利用液相色谱-串联质谱法测定牛奶中128种农药残留,但并未涉及日常检出率高、脂溶性强、易蓄积、难降解的有机氯、拟除虫菊酯等农药;GB/T 23210-2008《牛奶和奶粉中511种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》[16]由于采用GC-MS进行测定,使得许多农药的检出限已经无法满足目前的限量要求,例如牛奶中异狄氏剂的检出限为0.050 0 mg/L,乐果的检出限为0.016 7 mg/L,杀扑磷的检出限为0.008 3 mg/L等。总体上,国内外对于乳品中农药多残留的研究不论是在检测农药的数量上还是在农药种类的选择上,都存在一些不足。与传统的GC-MS相比,三重四极杆串联质谱具有极高的选择性、极强的抗干扰能力、高灵敏度和高通量离子传输效率及准确定量的特点,这使得该技术在复杂基质背景下仍能完成目标物的准确鉴定。本文利用固相萃取-气相色谱-三重四极杆质谱联用技术,建立了牛奶及奶粉中213种农药残留的高通量检测方法,测定的农药种类较全,涵盖了有机磷类、有机氯类、拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类等农药;并且采用多反应监测(MRM)模式和基质匹配标准溶液进行定量,减小了基质效应,降低了背景干扰,提高了分析灵敏度,可满足国内外对乳品中农药残留量的检测要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890A型气相色谱仪,Agilent 7000B型三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司);石墨化炭黑/氨基固相萃取柱(ENVI-Carb/NH2, 500 mg/500 mg, 6 mL, Supelco公司);旋转蒸发器(Heidolph公司)、PT 3100型均质器、Turbo Vap LV型氮吹浓缩仪(Zymark公司);Milli-Q纯化系统(Millipore公司)等。

213种农药标准物质(Dr. Ehrenstorfer和Sigma公司);乙腈、丙酮、正己烷均为色谱纯(Dikma公司);甲苯、无水硫酸钠和氯化钠均为分析纯(氯化钠使用前在140 ℃下烘烤4 h,在干燥器内冷却至室温,贮于密封瓶中;无水硫酸钠在650 ℃灼烧4 h,在干燥器内冷却至室温,贮于密封瓶中)。

1.2 实验方法

1.2.1标准溶液的配制

标准储备液:称取约5～10 mg(精确到0.1 mg)农药各标准物质分别置于10 mL容量瓶中,根据各物质的溶解性选用甲苯或丙酮溶解并定容至刻度，得到单标准储备液,置于-20 ℃冰箱中保存。

混合标准溶液:由于检测的农药品种较多,为确保较高的灵敏度,将农药分成A、B两组,并根据其在仪器上的响应确定混合标准溶液中各农药的浓度,移取一定量的各单标准储备液于容量瓶中,用丙酮-正己烷(1∶1, v/v)定容并配制成100 μg/mL的混合标准工作液,置于-20 ℃冰箱保存。

基质空白标准溶液:准确吸取适量混合标准工作液,用样品空白提取液配制成系列基质空白标准溶液,现用现配。

1.2.2样品前处理

1.2.2.1提取

牛奶:称取试样约10 g(精确到0.01 g)于50 mL离心管中,加入5 g氯化钠和20 mL乙腈,于涡旋振荡器上振荡2 min, 5 000 r/min转速下离心10 min,然后将上清液经装有10 g无水硫酸钠的漏斗过滤至120 mL鸡心瓶中。残渣再用20 mL乙腈重复以上提取过程,合并提取液,于40 ℃水浴浓缩至近干,用5 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)溶解所得浓缩液,待净化。

奶粉:称取试样约5 g(精确到0.01 g)于50 mL离心管中,加入20 mL 40～45 ℃水充分溶解并浸泡30 min,加入5 g氯化钠和20 mL乙腈,余下操作同牛奶样品。

1.2.2.2净化

将上述提取液通过石墨化炭黑/氨基固相萃取柱(使用前用10 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)活化),再用20 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)溶液分两次洗脱,控制流速为0.5 mL/min,收集全部流出液于同一离心管中,于40 ℃下用氮气吹干,加入1 mL丙酮-正己烷(1∶1, v/v)定容,超声溶解30 s,过0.22 μm有机相微孔滤膜,滤液供GC-MS/MS测定。

1.2.3气相色谱条件

色谱柱:DB-1701毛细管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);色谱柱升温程序:50 ℃保持1 min,然后以30 ℃/min升温至130 ℃,再以6 ℃/min升温至280 ℃,再以10 ℃/min升温至310 ℃,保持5 min;载气:氦气,纯度≥99.999%;流速:1.30 mL/min,恒流;进样口温度:290 ℃;进样量:1 μL;进样方式:不分流进样,1.5 min后打开分流阀。

1.2.4质谱条件

离子源:电子轰击离子(EI)源;离子源温度:250 ℃;四极杆温度:150 ℃; GC-MS/MS接口温度:280 ℃。溶剂延迟时间:5 min;碰撞气(氮气(N2))流速:1.5 mL/min,猝灭气(氦气(He))流速:2.25 mL/min。采用多反应监测(MRM)模式,每个农药选取2个特征MRM反应,其中一个作为定量离子对,一个作为定性离子对(见表1)。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的优化

本文考察的农药覆盖了有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、酰胺类、杂环类等极性和溶解度差异较大的多种类农药,因此要求提取溶剂对目标物有足够的溶解性和稳定性。牛奶的主要成分为水(含量在86%～89%之间),其他成分主要为脂肪、蛋白质、乳糖等,实验对目前应用较多的溶剂如丙酮、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷进行了筛选。结果发现,用丙酮和乙酸乙酯提取时,溶出的样品杂质、脂肪较多;而用二氯甲烷提取时容易乳化。乙腈通用性强,对农药溶解度较大,且具有沉淀蛋白质的作用,用乙腈提取不仅能沉淀蛋白质而且脂肪提出物和溶出杂质很少,且渗透能力强。实验考察了牛奶与乙腈的不同体积比(2∶1、1∶1、1∶2、2∶3)对沉淀蛋白质效果的影响。结果发现,当牛奶与乙腈的体积比为1∶2时,经离心分离后样品溶液澄清透明,蛋白质几乎沉淀完全。

由于氨基甲酸酯等农药水溶性强,奶粉直接用乙腈提取,回收率受很大的影响。实验发现,奶粉在加入有机溶剂提取前加入水浸泡30 min,可以提高提取效率。

2.2 固相萃取柱的选择

牛奶基质比较复杂,含有大量的脂肪和蛋白质,奶粉中还含有大量的糖,且涉及的农药种类及数量较多,因此需要去除蛋白质、脂肪等干扰物。尽管脂肪不溶于乙腈提取剂,但提取过程中仍会携带出少量的脂肪。实验选取了PSA、C18、QuEChERS法和ENVI-Carb/NH2柱等进行了比较,发现:PSA、QuEChERS法和C18对杂质的去除效果不好,基质增强效应明显,样品中还存在较多的干扰物质,对结果的测定有一定的干扰,有的农药的添加回收率异常,甚至高达210%; ENVI-Carb/NH2柱对含部分脂肪和脂溶性杂质的样品净化较好[17], ENVI-Carb能很好地吸附天然产物中的色素及固醇类等系列化合物[18],对于各种极性的分析物具有更广泛的保留范围并容易洗脱,可以改善多残留分析结果;NH2柱是弱阴离子吸附柱,能出色地分离结构异构体,并且对于样品中的一些强极性杂质、有机酸、色素和金属离子(与金属离子产生配合作用)等具有良好的净化效果[19],通过ENVI-Carb/NH2柱后,回收率和重现性较好,从而起到净化的效果。

比较了甲醇-二氯甲烷(1∶99, v/v)和乙腈-甲苯(3∶1, v/v)的洗脱效果,发现后者回收率高且干扰较小。选用乙腈作为洗脱剂,加入不同体积分数的甲苯(0、5%、10%、15%、20%、25%和30%)调节洗脱强度,实验发现,在洗脱剂体积不变的条件下,随着甲苯浓度的增加,洗脱下来的杂质相应减少;当甲苯浓度超过25%后,回收率降低,因此选用乙腈-甲苯(3∶1, v/v)作为洗脱剂。在洗脱体积的选择上,分别用5、10、15、20和25 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)混合液进行洗脱并收集。结果发现,回收率随着洗脱剂的体积增加而增加,但当体积达到20 mL后,继续增加洗脱液对回收率的影响不大。

表1 213 种农药的保留时间、特征离子及其碰撞能量，在牛奶中的线性相关系数、检出限和定量限，在牛奶和奶粉中的平均回收率及精密度( n = 6)Table 1 Retention times ( tR ) ，characteristic ions and their collision energies，correlation coefficients ( r) ，LODs and LOQs in milk，average recoveries and RSDs ( n = 6) in milk and milk powder of the 213 pesticides

表1 ( 续)Table 1 ( Continued)

表1 ( 续)Table 1 ( Continued)

表1 ( 续)Table 1 ( Continued)

表1 ( 续)Table 1 ( Continued)

表1 ( 续)Table 1 ( Continued)

2.3 农药品种的筛选

结合国内外对乳及乳制品中农药残留种类的考察范围,另外补充一些近年来在乳品中受关注比较多的农药种类,本文对235种农药进行了考察。实验过程中发现:①对于单一标准品,在GC-MS/MS上不出峰或信号低的有17种(甲胺磷、咪酰胺、霜脲氰、吡蚜酮、吡虫啉、吡氟禾草灵、多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵、辛硫磷、苯菌灵、烯酰吗啉、双甲脒、氧化乐果、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜); ②对于敌敌畏与敌百虫、溴氰菊酯和四溴菊酯这两对农药,由于敌百虫在一定温度下会降解生成敌敌畏,四溴菊酯在一定温度下降解生成溴氰菊酯,所以这两对农药的保留时间和质谱参数相同,国际上的限量标准是以二者残留量之和表示,所以对于回收率等检测指标,只考察了其中一种农药,即分别选取了敌敌畏和溴氰菊酯[20]; ③一级质谱母离子太小导致选择性差的农药未选(敌螨普母离子为m/z69); ④加入样品后受基质影响严重导致定量效果差的农药如百菌清、克菌丹未选。除去以上22种农药不出峰、响应差或干扰严重外,其余213种可进行准确的定性和定量分析。

2.4 质谱条件的优化

对213种农药的母离子、子离子、碰撞能量等一系列质谱参数进行了优化。首先选择母离子,对每一种农药以适宜的质量浓度进行全扫描(full scan),并从一级质谱图中选择适当的离子作为母离子;其次选择子离子,对选定的母离子用子离子扫描的方式确定二级质谱图,从中选择适宜的离子作为子离子;对每一组母离子/子离子分别选择不同的碰撞能量进行扫描,得到最优的碰撞能量(见表1)。图1为优化条件下213种农药的MRM图。

图1 213种农药(分为2组)混合标准溶液的MRM图Fig.1 MRM Chromatograms of the 213 pesticides in two groups

2.5 基质效应

减少基质效应影响的方法一般有:加入同位素标记的目标物;更多的净化步骤或进样前稀释;基质匹配标准溶液;分析物保护剂的加入等。其中,同位素标记物的种类少、价格昂贵;而更多的净化和稀释会增加样品前处理步骤,不仅耗时费力,减少目标物的覆盖范围,而且可能使目标物的定量限偏高,从而降低其灵敏度[21]。为了较好地减少基质效应的影响,本实验采用基质匹配标准溶液进行校正。基质效应(matrix effect，ME)=B/A×100%,其中,A为纯溶剂中农药的响应值,B为空白样品基质中添加相同含量农药的响应值。实验通过测定基质匹配标准溶液的平均响应值(B,n=3)和分析物在纯溶剂中的平均响应值(A,n=3)的比值来考察基质效应的大小,结果如图2所示。可以看出,在不同样品基质中,至少60%分析物的响应信号增强,而且不同基质在同一基质效应范围内化合物的数量不同,这是由于同一目标物在不同基质中所受的基质效应大小不同;奶粉中目标物的基质效应较牛奶中的显著,主要原因是牛奶含水量高,水分的增加在一定程度上稀释了基质共萃取物的浓度,从而降低了基质效应。其中,有机氯和拟除虫菊酯类农药的基质效应相对较弱,有机磷和氨基甲酸酯类农药的基质效应较强。因此,本文采用基质匹配标准溶液进行测定,能够很好地解决峰形较宽、保留时间漂移的问题,基本抵消了基质效应的干扰。

图2 牛奶、奶粉样品基质中213种农药(20 μg/kg)在 GC-MS/MS分析中的基质效应Fig.2 Matrix effects of the 213 pesticides (20 μg/kg) in extracts of milk and milk power during GC-MS/MS analysis

2.6 方法的线性范围、检出限和定量限

实验采用空白的牛奶和奶粉样品基质的提取液(按1.2.2节方法制备)配制不同质量浓度的农药基质标准溶液,用峰面积对质量浓度进行线性回归。结果表明,霜霉威、四氟醚唑、水胺硫磷、灭菌丹、烯丙菊酯、氟吡甲禾灵、缬霉威、噻嗪酮、乙嘧酚磺酸酯、乙氧氟草醚、嘧螨酯、炔草酯、苯醚菊酯、氟丙菊酯、丙硫克百威和苯醚甲环唑等16种农药在50～1 000 μg/L,其余197种农药在10～1 000 μg/L范围内呈线性关系,相关系数为0.993 9～0.999 9。方法的检出限(S/N=3)为0.03～7.59 μg/kg,定量限(S/N=10)为0.10～21.94 μg/kg。牛奶样品中213种农药标准曲线的相关系数、检出限和定量限结果见表1。

2.7 方法的回收率和精密度

在阴性的牛奶和奶粉样品中添加20、40、100 μg/kg的霜霉威、四氟醚唑、水胺硫磷、灭菌丹、烯丙菊酯、氟吡甲禾灵、缬霉威、噻嗪酮、乙嘧酚磺酸酯、乙氧氟草醚、嘧螨酯、炔草酯、苯醚菊酯、氟丙菊酯、丙硫克百威和苯醚甲环唑混合标准溶液,10、20、100 μg/kg的其余197种农药混合标准溶液,静置30 min,待农药被样品充分吸收后,按1.2.2节方法进行处理,做回收率试验,每个水平平行测定6次,计算精密度,结果见表1。结果表明,213种农药在牛奶及奶粉样品中的平均加标回收率为66.9%～120.1%,相对标准偏差(RSD)为1.23%～17.6%,回收率和精密度能够满足国内外对乳品检测的要求。

3 结论

通过对样品净化步骤的优化,本文建立了简单、高效测定牛奶和奶粉中213种农药残留的方法。该方法采用乙腈均质提取、石墨化炭黑/氨基固相萃取柱净化后用GC-MS/MS分析。与其他多残留分析方法相比,具有涵盖农药种类全、净化效果好、操作简单快捷等优点,可用于牛奶和奶粉中农药残留的日常检测。

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Determination of 213 pesticide residues in milk and milk power by gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry

WANG Jing1, AI Lianfeng1*, MA Yusong1, ZHANG Haichao1, LI Wei1, YU Meng2

(1.HebeiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shijiazhuang050051,China; 2.CollegeofFoodScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071000,China)

On the basis of the optimization of solid phase extraction adsorbent, eluting solvent types and amounts, a gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) method was established for the determination of 213 pesticide residues in milk and milk power. The samples were extracted by acetonitrile, cleaned-up with an ENVI-Carb/NH2solid-phase extractant, and determined by GC-MS/MS using external standard method. The linear ranges were from 10 to 1 000 μg/L for 197 pesticides, from 50 to 1 000 μg/L for the other 16 pesticides with the correlation coefficients higher than 0.99. The limits of detection (LODs,S/N=3) varied over the range of 0.03 to 7.59 μg/kg, and limits of quantification (LOQs,S/N=10) ranged from 0.10 to 21.94 μg/kg. The average recoveries in different matrices were in the range of 66.9%-120.1% with the relative standard deviations (RSDs) of 1.23%-17.6%. This method is simple, rapid, sensitive and reliable for meeting the requirements for the simultaneous identification and quantification of the multi-residues in milk and milk power.

gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry (GC-MS/MS); pesticide residues; milk; milk power

10.3724/SP.J.1123.2015.07012

国家质检总局科技计划项目(2013IK154);河北检验检疫局科研项目(HE2014K018).

2015-07-10

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1175-11

*通讯联系人.Tel:(0311)85980742,E-mail:ai_lianfeng@126.com.