基质固相分散-超高效液相色谱-质谱检测器测定牛奶中9种类固醇激素残留

刘宏程, 李 宁,2, 林 涛, 邵金良, 黎其万*

(1. 农业部农产品质量安全风险评估实验室(昆明), 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所, 云南 昆明 650223; 2. 昆明医科大学药学院, 云南 昆明 650500)

研究论文

基质固相分散-超高效液相色谱-质谱检测器测定牛奶中9种类固醇激素残留

刘宏程1, 李 宁1,2, 林 涛1, 邵金良1, 黎其万1*

(1. 农业部农产品质量安全风险评估实验室(昆明), 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所, 云南 昆明 650223; 2. 昆明医科大学药学院, 云南 昆明 650500)

利用基质固相分散技术(MSPD),建立了超高效液相色谱-质谱检测器(MSD)同时分析牛奶中9种类固醇激素残留的方法。便携式MSD的灵敏度和准确度优于紫外检测器;相比传统的质谱仪,MSD不需质谱参数优化,操作简便,开机抽真空时间短(只要5 min),即开即用。分别考察了流动相比例、萃取溶剂和固相萃取小柱净化对MSD灵敏度和牛奶样品基质效应的影响。结果表明,MSD正离子模式对吸电子基团化合物的灵敏度更高,受外界条件影响大。经MSPD净化后,9种类固醇激素的基质效应由84%～160%降低为80%～121%。方法学研究结果表明,9种类固醇激素的日内精密度和日间精密度分别为0.87%～1.78%和1.82%～3.79%,加标回收率为68.7%～94.7%,相对标准偏差(RSD)小于10%,方法检出限(LOD)为0.5～10 μg/kg,定量限(LOQ)为2～20 μg/kg。该方法适合日常大批量样品的检测。

基质固相分散;超高效液相色谱;质谱检测器;类固醇激素;牛奶

天然类固醇激素主要由动物的雌性、雄性性器官和肾上腺素器官产生,是动物生长发育的重要物质之一。人工合成很多类似结构的类固醇激素,主要有雄性激素(如睾酮)、雌性激素(如苯甲酸雌二醇)和促孕激素(如孕酮),为了治疗器官病变产生的疾病或促进生长、发育,需要注射人工合成激素,这些激素在动物体内很难分解,通过食物链进入人体后,可扰乱人体内分泌系统,导致男性女性化、男性生育能力下降、女性乳腺癌和卵巢癌、女性性早熟等[1,2]。农业部235号公告明确规定醋酸甲羟孕酮、甲基睾丸酮等为禁用兽药;苯甲酸雌二醇、丙酸睾酮为治疗允许药物,但不得在牛奶中检出。国际法典委员会(CAC)对醋酸甲羟孕酮在动物肝脏中的最大残留限量设定为10 μg/kg,对牛奶中睾酮、孕酮的最大残留限量未做限制。因此快速准确检测牛奶中这些类固醇激素对于保障牛奶的质量安全具有重要意义。

类固醇激素药物残留的相关检测方法已有很多报道[3],主要有酶联免疫法(ELISA)[4,5]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[6-8]、液相色谱法(HPLC)[9,10]以及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[11,12]等。ELISA因其高通量、高灵敏度等优点应用于大量样品的筛查,但方法假阳性率高,只能作为定性初筛。类固醇激素为非挥发性物质,需要进行硅烷甲基化[13,14]或者乙酰化反应[15]转化为挥发性成分才能进行GC-MS测定,操作复杂、耗时长。HPLC由于受检测器灵敏度的限制,检出限只能达到1～0.5 mg/kg[10]。LC-MS/MS是类固醇激素药物残留检测的常用技术之一,灵敏度高,但是仪器昂贵,基质效应明显[16,17]。这些方法多关注牛奶中睾酮、孕酮、甲基睾酮残留的测定,关于丙酸睾酮、双氢睾酮的多残留检测方法报道较少。

超高效液相色谱(UPLC)作为一种新的色谱方法,涵盖了小颗粒填料、低系统体积及快速数据收集等全新技术,具有柱效高、分离时间短、溶剂消耗少等优点[18-20]。目前UPLC系统带有一款便携式质谱检测器(MSD),灵敏度和准确度优于紫外检测器(PDA),摆脱了常规质谱仪的条件优化,操作简便,开机抽真空时间短(只要5 min),即开即用,适合日常大批量样品的检测。

本研究采用基质固相分散技术净化,建立了UPLC-MSD同时测定9种类固醇激素残留的高灵敏度方法。分别考察了流动相比例、萃取溶剂和基质固相分散材料对MSD灵敏度和对牛奶样品的基质效应的影响,提供了降低基质效应的有效方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪(Waters公司,ACQUITY UPLC H class型),配置四元泵溶剂淋洗系统、自动进样系统和便携式QDa质谱检测器。色谱柱BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters公司)。纯水器(Sartorius公司,Arium 611DI型)。C18填料(50 g, Supelco公司), Oasis HLB填料(10 g, Waters公司),带真空泵的12位固相萃取装置(Supelco公司)。

双烯雌酚(dienestrol,DE,纯度97.5%)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate,MPA,纯度98.5%)、甲基睾丸酮(methyltestosterone,MT,纯度99.8%)、苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate,EB,纯度99.5%)、丙酸睾酮(testosterone propionate,TP,纯度98.5%)、孕酮(progesterone,PT,纯度97.5%)、睾酮(testosterone,T,纯度98.5%)、双氢睾酮(androstan-17-ol-3-one,AT,纯度99.8%),左炔诺孕酮(levonorgestrol,LG,纯度98.5%)均购于德国Dr. Ehrenstorfer公司,结构式见图1。

乙腈、甲醇均为色谱纯(Merck公司),乙酸铵、甲酸为优级纯,国药集团化学试剂有限公司,其余试剂为分析纯。

1.2 标准溶液配制及样品制备

1.2.1标准溶液配制

除苯甲酸雌二醇用丙酮溶解外,其他标准品均用甲醇溶解,配制成500 mg/L标准储备液,于4 ℃冰箱中保存。

分别用甲醇逐级稀释,配制5个浓度的混合标准溶液,质量浓度为5、10、20、50、100 μg/L(其中AT和DE的质量浓度高10倍,为50、100、200、500、1 000 μg/L)。

图1 9种类固醇激素的分子结构式Fig.1 Chemical structures of the nine estrogenic steroids

1.2.2样品制备

准确量取5 mL牛奶样品,加入10 mL甲酸-乙腈(5∶95, v/v)混合溶液,涡旋混匀,加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸钠,混匀,以5 000 r/min离心5 min;取5 mL上清液,氮气吹至0.5 mL,加0.5 g HLB填料,在通风橱中放置10 min,挥干有机相,充分研磨,均匀装入底部垫上滤纸的10 mL注射器,上层再垫一片滤纸,并把填料轻轻压紧。先用6 mL水冲洗,不收集;抽真空10 min,以去除柱中残留水分。最后以2 mL甲醇洗脱3次,收集洗脱液,室温下氮吹至近干,用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(2∶8, v/v)定容至1 mL,混匀,经0.2 μm有机相滤膜过滤,上机分析。

1.3 色谱条件

BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱温35 ℃;进样量4 μL;流动相为0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.05 g/L乙酸铵)(A)-乙腈(B)(80∶20, v/v),流动相梯度:0～3 min, 80%A～40%A(保持1 min); 4～5 min, 40%A～20%A(保持1 min); 6 min回到初始状态。流速0.3 mL/min; MSD扫描方式:正、负离子同时扫描;扫描质量数范围:m/z30～400;毛细管电压:0.8 kV; Selected ion recording (SIR)扫描模式,锥孔电压15 V,采样速率8点/s。定量离子和保留时间如表1。

表1 9种类固醇激素的定量离子和保留时间

2 结果与讨论

2.1 MSD性能和色谱条件的优化

由于MSD为便携式质谱仪,简化了传统质谱仪需要标准品进行优化质谱电压的繁琐操作,通过全扫描模式(正/负离子)可确定目标化合物的保留时间和监测离子,这些化合物均在正离子模式下出峰,其定量离子见表1。

对色谱分离条件和MSD性能进行考察。按照1.3节色谱条件对100 μg/L混合标准溶液进行分离,SIR模式检测。当流动相A相选择为水时,只有PT、T、TP、MPT、LG和MT等6个化合物出峰。A相为氨水(0.05%, pH=9)时,与水为流动相的结果一致。当选择酸(0.1%(v/v)甲酸水溶液,含0.05 g/L乙酸铵)为流动相时,才能保证9个化合物同时出峰。同时研究发现,流动相比例对PT、T、TP、MPT、LG和MT等6个化合物的峰响应影响大,这6个化合物在A相/B相(80/20, v/v)条件下的相应比A相/B相(40/60, v/v)条件下峰高响应高10倍,但对AT、EB和DE这3个化合物的峰高响应没有影响。有机相使用乙腈比使用甲醇时目标物的峰响应高。从图1可知,PT、T、TP、MPT、LG和MT等6个化合物均含有环己烯酮,在酸性条件下容易电离,AT为环己酮、EB和DE为酚酸,酸性条件不容易电离,因此MSD正离子模式对吸电子基团化合物灵敏度更高,受流动相影响大。

由于流动相同时影响灵敏度和分离度,通过优化条件,选择A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.05 g/L乙酸铵), B相为乙腈,初始比例为80%A,梯度洗脱,6 min内能完全分离9种类固醇激素,其中AT和DT、PT和MPA、LG和EB的保留时间相差0.036～0.075 min,分离度R分别为1.0、1.5、1.5,体现了UPLC的分离优势,相比文献[16]采用LC-MS/MS的18 min分离条件,分离时间缩短为原来的1/3(见图2)。

图2 选择离子检测(SIR)扫描模式下类固醇激素 标准溶液的质谱图Fig.2 Mass spectra of a standard mixture of the nine estrogenic steroids in selected ion recording (SIR) mode

2.2 基质效应的影响

由于便携式MSD为ESI电离模式,可能存在基质效应(离子增强或离子抑制)。基质效应(ME)可以表示为同一添加浓度的被分析物在基质中的信号与分析物在有机溶剂中的信号比值,如公式(1):

ME=Am/Ao×100%

(1)

其中Am和Ao表示被分析物在基质中和在有机溶剂中的峰面积,当基质效应在80%～120%之间表明基质效应可以忽略,但基质效应在50%～80%和120%～150%之间时,需要考虑如何消除基质效应。

图3 采用两种溶剂萃取时类固醇激素的基质效应Fig.3 Matrix effects of the estrogenic steroids with two extraction solvents

参照文献选择乙腈[16]和酸性乙腈[17]作为萃取溶剂,按照1.2.2节萃取方法对添加100 μg/kg混合标准溶液的牛奶样品进行基质效应考察,结果见图3。从图3可知,以乙腈或者甲酸-乙腈(5∶95, v/v)作萃取溶剂时,T、TP和MT等3个化合物有明显的基质效应,但以甲酸-乙腈(5∶95, v/v)作萃取溶剂时其他化合物的基质效应低于乙腈作萃取溶剂,因此选择甲酸-乙腈(5∶95, v/v)作为提取溶液。

2.3 基质固相分散填料对样品的净化效果

MSPD的原理是将样品和键合固定相载体混合研磨使样品组织细胞碎裂,待测组分通过扩散进入键合的有机相,然后选择合适洗脱强度的溶剂把待测组分洗脱出来。常用的键合固定相有C18等[21]。在牛奶中加入100 μg/kg混合标准品,按照1.2.2节样品处理,比较C18和HLB填料对牛奶的净化效果和目标化合物的回收率。由于HLB为N-乙烯吡咯烷酮和亲脂性二乙烯基苯聚合而成,对亲水亲脂基质有吸附,对牛奶样品的净化效果比亲脂的C18性能好,从目标化合物MT的色谱图(m/z303,图4)可看出,HLB对杂质(4.892和5.187 min)的净化效率比C18的高,图5为加标牛奶样品的典型色谱图,每个通道目标化合物均能很好地定性定量。

图4 两种填料净化后的加标样品色谱图(m/z 303)Fig.4 Chromatograms of a spiked sample with two MSPD (m/z 303)

图5 加标牛奶样品的色谱图Fig.5 Chromatograms of a spiked milk sample

通过HLB填料净化后,9种类固醇激素的基质效应由84%～160%变为80%～121%,基本消除基质效应的影响,回收率可以达到75%～100%;但使用C18填料净化,还是不能消除T、TP和MT的基质效应。

2.4 方法学确证

2.4.1定量标准曲线、检出限

采用1.2.1节方法制备混合标准溶液,按优化后的检测条件进样,以各定量离子的峰面积对质量浓度做标准曲线,得到9种化合物的线性方程及其相关系数。9种类固醇激素在5～100 μg/L(其中AT、DE和EB为50～1 000 μg/L)范围内线性关系良好,其检出限(LOD)(根据S/N=3计算)和方法的定量限(LOQ)(根据S/N=10计算)见表2。从表2可知,T、TP、PT这几种化合物的灵敏度达到欧盟对牛奶中类固醇激素残留限量要求和接近文献[16]LC-MS/MS方法的灵敏度,AT、DE和EB的灵敏度比LC-MS/MS差很多。

表2 回归方程、相关系数(R2)、检出限及定量限

Y: peak area, mV×s;X: mass concentration, μg/L.

2.4.2日内稳定性、重复性和回收率试验

将100 μg/L的混合标准溶液在一天内重复测定5次,计算每个目标化合物峰面积的相对标准偏差(RSD);在5天内每天重复进样测定,计算每个目标化合物峰面积的RSD,结果表明,9种类固醇激素的日内精度和日间精密度分别为0.87%～1.78%和1.82%～3.79%,表明9种类固醇激素在常温下是稳定的。

选择空白牛奶,分别添加5、50、100 μg/kg进行回收率和重复性试验,每个水平重复5次测定。结果见表3。从表3可知,所有目标化合物的回收率在68.7%～94.7%之间, RSD小于10%。

表3 方法的准确度和精密度(n=5)

3 结论

本工作建立了基质固相分散-UPLC-MSD同时测定牛奶中9种类固醇激素残留量的方法,研究发现MSD对含有吸电子基团的化合物灵敏度高,受流动相影响大,初始化流动相中酸比例高,峰响应值高。对基质固相填料的考察发现,经HLB填料净化后,可有效降低基质效应,而C18填料不能消除T、TP和MT等化合物的基质效应。

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2016年度《分析化学》杂志征订启事

邮发代号12-6

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分析化学编辑部 供稿

Determination of nine estrogenic steroids in milk using matrix solid phase dispersion-ultra performance liquid chromatography with mass spectrometric detector

(1.DivisionofChemicalMetrologyandAnalyticalScience,NationalInstituteofMetrology,Beijing100029,China; 2.PolytechInstrument,Beijing100095,China)

LIU Hongcheng1, LI Ning1,2, LIN Tao1, SHAO Jinliang1, LI Qiwan1*

(1.LaboratoryofQuality&SafetyRiskAssessmentforAgro-Product(Kunming),MinistryofAgriculture,QualityStandardandTestingTechnologyInstituteofYunnanAcademyofAgricultureScience,Kunming650223,China; 2.DepartmentofPharmaceuticalScience,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China)

An analytical method for the multiresidue determination of nine estrogenic steroids in milk was developed by modified matrix solid phase dispersion (MSPD) purification and ultra performance liquid chromatography (UPLC) with mass spectrometric detector (MSD). The sensitivity and accuracy of MSD were better than that of ultraviolet detector. In comparison with traditional mass spectrometry, the merits of MSD were simpler in operation and shorter in starting time (5 min). The results showed that the limits of detection of the compounds with nucleophilic substitution were high in positive ion mode of MSD and were easily affected by environmental conditions. The matrix effects of milk samples reduced from 84%-160% to 80%-121% after MSPD purification. The intraday precision and interday precision of the nine estrogenic steroids were 0.87%-1.78% and 1.82%-3.79%, respectively. The average recoveries were 68.7%-94.7%, and the relative standard deviations (RSDs) were less than 10%. The limits of detection (LODs) were 0.5-10 μg/kg. The limits of quantification (LOQ) were 2-20 μg/kg.

matrix solid phase dispersion (MSPD); ultra performance liquid chromatography (UPLC); mass spectrometric detector (MSD); estrogenic steroids; milk

10.3724/SP.J.1123.2015.06035

云南省科技惠民计划重点项目(2013RA012);科技创新平台建设计划项目(2014DA001).

2015-06-23

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1163-06

*通讯联系人.E-mail:cmliu_0@sina.com.