无水乙醇萃取联合氧化铝柱层析制备高纯磷脂酰胆碱

宋范范，张康逸,*，张薇薇，何梦影

(1.河南省农业科学院农副产品加工研究所,河南 郑州 450003；2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南 郑 州 450002)

无水乙醇萃取联合氧化铝柱层析制备高纯磷脂酰胆碱

宋范范1，张康逸1,*，张薇薇2，何梦影1

(1.河南省农业科学院农副产品加工研究所,河南 郑州 450003；2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南 郑 州 450002)

以大豆粉末磷脂为原料，采用无水乙醇萃取和氧化铝柱色谱相结合的技术， 研究了高纯度磷脂酰胆碱的制备方法。乙醇萃取后磷脂酰 胆碱的纯度为62.00%，得率为31.94%。主要考察了柱层析过程中的固定相、洗脱液浓度、上样量、料液比及洗脱液流速对分离效果的影响。结果表明:当固定相为100～200 目三氧化二铝、洗脱液为90%乙醇、上样量为1 g/30 g、料液比为1∶12（g/mL）、 洗脱液流速为3.0 mL/min时，磷脂酰胆碱的纯度可达到94.52%，回收率为83.71%。该研究结果为进一步探讨工业化制备磷脂酰胆碱的研究提供了技术支持和数据支撑。

磷脂酰胆碱；柱色谱；氧化铝；粉末磷脂

磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）俗称卵磷脂，它是目前世界上公认的最具有生物活性的磷脂，已被 广泛应用于食品、医药、保健、化妆品、饲料等行业中[1-5]。但是，如何提高PC的纯度问题一直制约着PC的应用。大豆PC的纯化方法主要分为溶剂萃取[6-8]、无机盐沉淀[9]、超临界CO2技术[10-12]、膜分离法[13]和柱层析法[14-15]等。溶剂萃取法溶剂用量和损耗过大，且存在毒性会对环境造成污染；无机盐沉淀法虽然可以提高PC的纯度，但会导致产品中无机盐的残 留量增加；超临界技术虽具有绿 色无污染和产品纯度高的优点，但设备费用过高，动力消耗大，不利于工业化生产[16]。综合多种纯化工艺，柱层析法在纯化PC的工艺中效果最理想，故近年来很多磷脂工作者开始着力研究柱层析法纯化PC的工艺[17]。

曹栋[18]考察了几种不同体积分数的乙醇洗脱液对氧化铝柱层析制备高纯度PC的影响，该研究未对柱层析过程中的影响因素进行考察。郭勇等[19]采用无水乙醇浸提和氧化铝层析柱结合法可从粉末磷脂中分离纯化出纯度达到90%的PC，其最佳工艺条件为浸提次数1 次，溶剂倍数4 倍，浸提温度20 ℃，搅拌时间15 min，但实验也没有深入研究固定相、上样量、洗脱液流速及上样浓度对提取效果的影响。张颖颖等[20]以大豆浓缩磷脂为原料，用混合溶剂（正己烷-异丙醇-水）为流动相，研究了硅胶柱中PC的纯化效果，当固定相为100～200 目粗孔2号硅胶，正己烷-异丙醇-水（1∶1∶0.16，V/V），上载量0.086g PC/g硅胶时，产品中PC的纯度可达到85%。但混合流动相的使用给溶剂的回收利用带来了困难，使得这一方法很难应用于工业化生产。陈慧等[21]比较了中性氧化铝和中性硅胶作为固定相时的分离效果，考察了原料浓度对纯化效果的影响，未对其他因素的影响做出研究。王成涛[22]将冷冻结晶纯化法得到的粗PC通过柱层析进行纯化分离得到高纯度PC（≥90%），对影响PC纯度的因素也进行了考察，但未对产品与其他组分的分离效果进行研究。

本实验结合无水乙醇萃取和柱色谱技术对PC的分离纯化进行了研究，该萃取柱层析联用的制备方法可降低直接使用粉末磷脂为原料进行柱层析纯化的负担，并提高纯化效果。通过绿色溶剂无水乙醇对粉末磷脂进行萃取制备粗PC，然后使用柱层析对其进行纯化，并考察柱层析过程中的固定相、洗脱液浓度、上样量、料液比及洗脱液流速对PC分离效果的影响。通过本研究的开展，以期为PC的工业化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆粉末磷脂（纯度≥96%，PC30%、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)25%、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)25%、溶血磷脂酰胆碱(lyso-phosphatidylcholine,LPC)0.5% 天津市博帅工贸有限公司；无水乙醇（分析纯） 烟台双双化工有限公司；甲醇（色谱纯） 美国honeywell公司；氧化铝（100～200 目） 上海五四化学试剂有限公司；硅胶（100～200 目） 青岛海洋化工；层析柱（Φ15 mm×50 cm） 郑州兴华玻璃仪器厂。

1.2 仪器与设备

1260型高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司；DHL-B电脑数显定时恒流泵 上海沪西分析仪器厂；自动部分收集器 上海青浦沪西仪器厂；SY-5000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 粗PC的制备

以大豆粉末磷脂为原料，在溶剂为无水乙醇、 温度20 ℃、时间15 min、料液比1∶4（g/mL）的条件下进行萃取，离心上清液并浓缩得到粗PC。

1.3.2 层析柱的制备

将活化过的氧化铝加入无水乙醇制成浆状,装柱,洗涤,平衡。

1.3.3 高效液相色谱-蒸发光散射检测器条件

色谱柱型号:A g i l e n t Z O R B A X R X-S I L（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温:35℃；流速: 1.0 mL/min；流动相:A:甲醇，B:甲醇-水（8∶1，V/ V）；进样量5 μL。流动相:溶剂A（甲醇-水8∶1，V/ V），溶剂B（甲醇），流速1.0 mL/min；洗脱梯度: 0～10.0 min，60%～40% A；10.0～20.0 min，40% A；20.0～20.1 min，40%～60% A；20.1～25 min，60% A。

图8 为总氮的分析结果，由图8可以看出降雨开始时总氮为0.8mg/L，为Ⅲ类水体；降雨开始4小时后污染物浓度达到峰值1.4mg/L，为Ⅳ类水体；降雨开始6小时后，由于稀释作用，基本恢复为Ⅲ类水体。之后随着第二次降雨峰值的出现，水质有一定的恶化。总体而言，降雨径流对总氮的影响较小，一天中超过Ⅲ类水质时间约为6小时，降雨径流对总氮的浓度变化存在一定影响，但在可接受范围内。

单因素试验:以自制粗PC为原料进行柱层析，无水乙醇为洗脱液、上样量0.5 g/30 g、料液比1∶12（g/mL）、洗脱液流速3.0 mL/min。固定其他条件，分别考察固定相（硅胶、氧化铝）、洗脱剂体积分数（100%、95%、90%、85%、80%乙醇）、上样量（0.5、1、2、4 g/30 g）、料液比（1∶16、1∶14、1∶12、1∶8（g/mL）、洗脱液流速（2.5、3.0、3.5、4.0 mL/min）对分离效果的影响，每组实验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 粗PC的制备

图1 原料粉末磷脂(A)与粗PC(B)的色谱图Fig.1 Chromatograms of soybean lecithin powder (A) and purified PC (B)

由于磷脂中各组分的结构存在差异，故各种组分在同一种溶剂中的溶解度也会不同。PC在乙醇中的溶解度相对较大，而PI和PE的溶解度相对较低，因此采用乙醇萃取法可对PC进行纯化，得到纯度相对较高的PC。从图1可以看出，通过乙醇萃取，PC的纯度可从26.13%提高到62.00%，提取率为31.94%。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 固定相对分离效果的影响

由于PC的分子质量在600～700 D左右，分子体积比较大，故孔容较大的固定相对PC的分离效果会比较好[20]。且相关文献指出氧化铝对PI和PE的吸附性较强，用乙醇溶液难以洗脱[23]。故本研究考察了100～200 目的氧化铝和硅胶为固定相时的分离效果。由图2可知:氧化铝做为固定相时，PC的洗脱谱带分布较窄，且最初流出的洗脱溶液中PC的含量较高；而 采用硅胶做固定相时，PC的洗脱谱带分布很宽，收集液中PC含量较少，且分离时间较长，不利于PC的收集。因此，本实验确定氧化铝为最适固定相。

图2 不同固定相下PC的洗脱曲线Fig.2 Elution curves of PC on different stationary phases

2.2.2 洗脱剂体积分数对分离效果的影响

图3 不同洗脱剂下的洗脱曲线Fig.3 Elution curves with different ethanol concentrations

由图3可以看出，随着乙醇体积分数的升高，PC和PI的分离效果越来越好，体积分数低于90%时，PC和PI的流出时间较早，二者分离效果不好，无水乙醇作为洗脱剂时，PC和PI的流出曲线拖尾现象较严重，不利于PC的收集和纯化。当采用90%的乙醇为洗脱剂时，PC和PI得到了较好地分离，且洗脱液中PC的含量较高，后续浓缩的PC样品纯度较高。这说明不同体积分数的洗脱剂下，被分离组分和固定相之间的作用力不同。随着洗脱剂体积分数的降低，固定相氧化铝对PC和PI的吸附作用降低，PC和PI的流出速度越快，流出时间越早。这可能是由于含水量较高时，洗脱剂与被分离组分的作用力要明显大于固定相与被分离组分之间的作用力。因此，若要得到较高纯度的PC，必须在适当条件下将PC和PI的流出时间错开。综上所述:选用90%乙醇为最佳的洗脱剂。

2.2.3 上样量对分离效果的影响

上样量的多少对层析效果的好坏有很大的影响。一定条件下，洗脱剂、固定相和被分离样品之间吸附作用存在平衡。若上样量过小，一部分样品会被固定相吸附，难以解吸下来，使样品得率下降；若上样量过大，会造成样品出峰过早，不利于样品各组分间的分离。

图4 不同上样量的洗脱曲线Fig.4 Elution curves with different loading amounts

由图4可知，随着上样量的增加，PI和PC的流出曲线重叠现象比较严重，PC的分离效果逐渐变差，这一现象与秦孝敏的研究结果一致[24]。当上样量为0.5 g/30 g时，PI和 PC可以 得到明显分离，但洗脱液中PC含量偏低；上样量为2 g/30 g和4 g/30 g时，洗脱液中PC含量高，但PI和PC未被分开；上样量为1 g/30 g时，PI和PC分离效果好，且所分离的PC含量高。综上所述: 选用1 g/30 g为最佳上样量。

2.2.4 料液比对分离效果的影响

图5 不同料液比的洗脱曲线Fig.5 Elution curves with different loading concentrations

由图5可知，不同料液比对PC的流出时间和洗脱谱带的影响不大。当料液比为1∶8（g/mL）时，洗脱液中PC含量 较低，这可能是因为该浓度条件下部分PC被氧化铝固定相吸附，导致收集液中PC含量下降。为了便于后续浓缩和回收洗脱液，选用1∶12（g/mL）为最适料液比。

2.2.5 洗脱液流速对分离效果的影响

在利用柱层析分离样品时，洗脱液流速应低于被分离组分与固定相间的吸附解吸速度，而高于洗脱液在层析柱中的自然沉降速度。如果流速过大，被分离组分不能及时被固定相吸附就提前流出，这会导致所收集的组分纯度下降；如果流速过小，会使被分离组分与固定相的吸附时间延长而不利于收集。

图6 不同洗脱液流速的洗脱曲线Fig.6 Elution curves with differe nt flow rates

由图6可以看出，随着洗脱液流速的升高，PC的流出时间逐渐提前，即PC的保留时间缩短。然而，PC的响应值和纯度随着流速的升高开始下降，这可能是由于流速较高时其他组分在层析柱中的保留时间相对缩短而过早流出造成。在流速为3.0 mL/min时，PC的响应值较高且流出时间较早。故为了保证柱层析分离的效率，必须控制相对合适的洗脱流速。本实验选择3.0 mL/min为最佳洗脱液流速。

3 结 论

本实验采用无水乙醇萃取和氧化铝柱色谱相结合的技术，研究了高纯度PC的制备方法。与他人[18,21]的分析法相比，本实验 采用的洗脱曲线能清晰表示出PC的洗脱效果，且萃取柱层析联用的制备方法降低了直接以粉末磷脂为原料进行柱层析纯化的负担，洗脱液经检测只含有PI和PC，分离效果明显。然而，洗脱液中并未检测到PE，原因可能是PE被固定相氧化铝吸附不易被洗脱出来，这一推测已列入后续研究计划当中。乙醇萃取后PC的纯度为62.00%，得率为31.94%。单因素试验结果表明:当固定相为100～200 目氧化铝、洗脱液为90%乙醇、上样量为1 g/30 g、料液比为1∶12（g/mL）、洗脱液流速为3.0 mL/min时，PC的纯度可达到94.52%，回收率为83.71%，该研究结果为进一步工业化制备高纯度PC提供了重要的数据参考。

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Preparation of Highly Purified Phosphatidylcholine by E thanol Extraction and Alumina Column Chromatography

SONG Fanfan1, ZHANG Kangyi1,*, ZHANG Weiwei2, HE Mengying1
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450003, China; 2. School of Food and Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China)

Phosphatidylcholine (PC) was purified from soybean lecithin powder by ethanol extraction and aluminum column chromatography. After the extraction, the purity and yield of PC were 62.00% and 31.94%, respectively. The influence of important chromatographic parameters such as stationary phase, ethanol concentration, loading am ount, solid-to-liquid ratio, and elution flow rate on separation effic iency was in vestigated. Highly p urified PC with a purity of 94.52% and a yield of 83.71% was obtained under the optimized conditions: alumina powder (100-200 mesh) as the stationary phase, elution with 90% ethanol at a flow rate of 3.0 mL/min, loading amount of 1 g/30 g, and solid-to-liquid ratio of 1:12 (g/mL). This study will hopefully provide technical support and data for industrial production of PC.

phosphatidylcholine; column chromatography; aluminum; soybean lecithin powder

TS229

A

10.7506/spkx1002-6 630-201510002

2014-07-23

国家自然科学基金青年科学基金项目(31301502)；河南省农业科学院优秀青年科技基金项目(2013YQ25)

宋范范(1988—),女,硕士,主要从事脂质科学研究。E-mail：1122yang@163.com

*通信作者：张康逸(1981—),男,副研究员,博士,主要从事脂质科学研究。E-mail：kangyiz@163.com