次氯酸钠消毒处理条件对鸡爪中氨基脲残留的影响

2015-01-03沈金灿谢冬冬康海宁郑宗坤赵凤娟王之维

食品科学 2015年10期

沈金灿，谢冬冬，康海宁，郑宗坤，赵凤娟，王之维

（1.深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心，广东深圳 518045；2.深圳市食品安全检测技术研发重点实验室，广东深圳 518045；3.深圳大学化学与化工学院，广东深圳 518060）

沈金灿1,2，谢冬冬3，康海宁1,2，郑宗坤3，赵凤娟1,2，王之维3

为探究不同条件下次氯酸钠消毒处理后对产生氨基脲残留的影响，以鸡爪为研究对象，考察次氯酸钠浓度、温度、浸泡时间、pH值等因素的影响。样品经次氯酸钠溶液处理后，在酸性条件下采用2-硝基苯甲醛进行衍生，调节pH值至中性后用乙酸乙酯提取，液相色谱-串联质谱仪进行测定，同位素内标法定量。结果表明，有效氯质量浓度、温度及浸泡时间与氨基脲产生量呈明显的正相关性；在pH 9～12范围内，鸡爪中氨基脲产生量随着浸泡溶液pH值的升高而增大。消毒处理过的样品经水漂洗后氨基脲含量减少50%～60%。

次氯酸钠；消毒；鸡爪；氨基脲；处理条件

氨基脲（semicarbazide，SEM）属于联氨类化合物中的一种，是一种具有致癌性和基因毒性的有害物质[1-4]。一直以来，SEM被认为是硝基呋喃类兽药呋喃西林的代谢产物[5]。因此，SEM常作为监测食品中非法使用呋喃西林的残留标志物。但是近期的研究[6-9]发现食品中SEM的来源有多种途径，除了呋喃西林原药在动物体内代谢会产生SEM外[5-6]，食品或食品接触材料中偶氮甲酰胺的高温热解[7-9]，甲壳类水产品[10]，环境水污染[11]，以及食品的化学消毒处理均易导致SEM的污染[12]。近年来化学消毒作为一种快捷有效的消毒方式越来越多用于食品加工的消毒处理。次氯酸钠作为一种食品的广谱消毒剂，在水及动物产品的加工处理中得到了广泛的应用[13-14]。但是，最近的研究表明采用较高质量浓度的次氯酸钠处理食品会产生严重的SEM残留[15]。在日常进出口食品检测中已多次从进口鸡爪中检出SEM含量超标，导致鸡爪SEM超标主要是由于使用了含氯消毒剂进行消毒处理。为了系统地探究不同条件下次氯酸钠处理鸡爪对SEM产生量的影响，本实验分别考察浓度、温度、时间、pH值等因素对SEM产生量的影响，以及漂洗对SEM去除的效果。研究结果对于指导食品生产企业控制和减少化学消毒食品中SEM的残留，提高产品的竞争力具有重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

SEM盐酸盐和SEM同位素标准品（纯度≥99%）德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙腈（均为色谱纯）德国Merck公司；乙酸铵、磷酸三钠、氢氧化钠、氯化钠、硫代硫酸钠（均为分析纯）天津市福晨化学试剂厂；次氯酸钠溶液（有效氯10%）天津富宇精细化工有限公司；2-硝基苯甲醛（≥98.0%）上海安谱公司。实验用水由Milli-Q纯水仪制备。

Xevo TQ-S型液相色谱-串联质谱仪美国Waters公司；Turbo Vap LV型吹氮浓缩仪美国Zymark公司；旋涡振荡器台湾Polytron公司；3-18k型高速冷冻离心机美国Sigma公司。

1.2 样品前处理[12-15]

1.2.1 次氯酸钠溶液消毒处理

称取样品1.00 g于10 mL离心管中，根据实验需要分别加入不同有效氯质量浓度的次氯酸钠溶液2.0 mL，旋涡振荡30 s，置于振荡器上振荡1h，反应结束加入0.1 mL 1.0 mol/L的Na2S2O3溶液以除去未反应的次氯酸钠。

1.2.2 衍生与提取净化

SEM的衍生与提取净化参考GB/T 21311—2007《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相串联质谱法》方法[16]。经次氯酸钠处理后的样液中加入3 mL 0.4 mol/L HCl溶液，再加入0.1 mL 20 mg/L内标工作液，涡旋混合30 s，使内标物完全渗透到样品中；再加入0.1 mL 30 mg/mL的2-硝基苯甲醛溶液，涡旋30 s后，置于37 ℃恒温振荡器中振荡衍生16 h。衍生后，加入0.5 mL 0.3 mol/L的Na2HPO4溶液混匀，用0.2 mol/L盐酸或NaOH溶液将pH值调至7.0～7.5；加入5.0 mL 乙酸乙酯，涡旋60 s，以10 000 r/min离心5 min，取上层清液至15 mL 离心管；剩余残渣再加入5.0 mL乙酸乙酯进行提取，以10 000 r/min离心5 min后合并上清液，提取液于40 ℃水浴条件下氮气吹干。准确加入1.0 mL 5%的乙酸铵溶液-甲醇溶液（9∶1，V/V），再加入2.0 mL正己烷，涡旋混合1 min；以10 000 r/min离心5 min，去除上层溶液后过0.22 mm滤膜，供液相色谱-质谱测定。

1.2.3 标准工作液的配制

SEM标准储备液和标准中间液配制:准确称取2.99 mg SEM盐酸盐标准品，用甲醇溶解并稀释至10 mL棕色容量瓶中，即得200 mg/L的标准储备液，-18 ℃保存。取适量标准储备液，用甲醇逐级稀释，配制成质量浓度为10 μg/L的标准中间液，-18 ℃保存。

SEM同位素内标储备液和中间液配制:准确称取2.97 mg SEM同位素内标标准品，用甲醇溶解并稀释至10 mL棕色容量瓶中，即得200 mg/L的内标标准储备液，-18 ℃保存。取适量标准储备液，用甲醇逐级稀释，配制成质量浓度为100.0 μg/L的内标标准中间液，-4 ℃保存。

工作曲线标准液:分别准确移取一定量的标准中间液和同位素内标中间于5 个装有1.0 g空白样品的15 mL离心管中，使其最终SEM质量浓度分别为0、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/L和10.0 μg/L，内标质量浓度均为2.0 μg/L，按1.2.2节方法进行样品处理。

1.3 色谱-串联质谱分析条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱:A C Q U I T Y B E H C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温:30 ℃；流速: 250 μL/min；流动相:A为0.01% 甲酸（含5 mmol/L乙酸铵）溶液，B为甲醇；进样量:10 μL。梯度洗脱条件为:0～5 min，90% A；5.1～6 min，50% A；6.1～7.5 min，0% A。

1.3.2 质谱条件

离子源:电喷雾离子源，正离子检测，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；离子源温度:120 ℃；去溶剂温度:350 ℃；锥孔气流流速: 100 L/h；去溶剂气流流速:600 L/h；碰撞气体为氩气，碰撞气压:2.6×10-4Pa；毛细管电压:3.5 kV。

表1 MRM所用的母离子和子离子Table1 Precursor/daughter ions used in multiple reaction monitoring (MRM)

2 结果与分析

2.1 方法的线性范围、检出限及回收率

按1.2.3节的方法制备标准工作液，经液相色谱-串联质谱测定后，以质量浓度为横坐标，SEM峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线。实验表明，SEM质量浓度在0～10.00 μg/L范围内与其峰面积比值呈良好的线性关系，回归方程为y=0.006 332 22+ 0.527 985x，线性相关系数r为0.999 9。方法的检出限为0.02 μg/kg（RSN≥3），定量限为0.07 μg/kg（RSN≥10）。

表2 鸡爪中SEM加标回收率及精密度(n=6)Table2 Results of recovery test and precision from chicken claw samples (n=6)

由表2可见，SEM添加量为0.5 μg/kg和1.0 μg/kg时，平行测定6 个样品，其回收率为96.0%～106.5%。SEM标准溶液MRM色谱图见图1。

图1 SEM标准溶液(1.0 ☒g/kg)的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of semicarbazide standard solution (1.0 ☒g/kg)

2.2 次氯酸钠溶液有效氯质量浓度对鸡爪中SEM产生量的影响

实验考察了次氯酸钠溶液中不同有效氯质量浓度（0、100、200、500、1 000、2 000 g/L及5 000 mg/L）下对鸡爪中SEM产生量的影响，样品平行测定3份，取平均值，结果如图2所示。

图2 浸泡质量浓度对SEM产生量的影响Fig.2 Effects of sodium hypochlorite concentration on the production of SEM

从图2可以看出，经过次氯酸钠处理后鸡爪中会有不同程度的SEM产生，当次氯酸钠溶液中有效氯质量浓度在200 mg/L以上时，均可以明显地检测到SEM；随着次氯酸钠质量浓度的增加，SEM产生量也在逐渐增加，SEM产生量与有效氯质量浓度呈现较好的线性相关关系，线性相关系数为0.954 3。研究结果与Honicke[15]和杨曦[17]等的结果相一致，即随着溶液中有效氯的增加，SEM产生量不断在增加。次氯酸钠处理鸡爪中产生SEM的原因，可能是由于鸡爪经消毒水处理后分解产生氨基酸或氨基酸衍生物，部分氨基酸（精氨酸）及氨基酸衍生物（肌酸及肌酸酐）在次氯酸钠作用下分解产生SEM；另外有部分氨基酸进一步分解为尿素和氨，氨与次氯酸钠作用产生氯胺，氯胺与尿素在一定条件下也能产生SEM[15]。

2.3 浸泡温度对鸡爪产生SEM的影响

鸡爪样品中分别定量添加有效氯质量浓度为500、1 000、2 000 mg/L 次氯酸钠溶液，考察4、25、37 ℃温度条件下经次氯酸钠溶液浸泡1 h后，测定样品中SEM产生量（样品平行测定3 份，取平均值），结果如图3所示。由图3可以看出，SEM产生量与浸泡温度具有正相关性，温度越高产生的SEM量越多，在有效氯质量浓度为500、1 000、2 000 mg/L条件下，形成SEM量分别从浸泡温度4 ℃时的0.259、1.066、2.354 μg/kg，增加到37℃时的0.655、1.457、3.024 μg/kg。该结果表明浸泡温度越高越有利于次氯酸钠溶液与鸡爪样品的反应，因此产生的SEM含量越高；温度对于低质量浓度有效氯的影响比高质量浓度有效氯的大，500 mg/L质量浓度的有效氯溶液在37 ℃产生SEM的量是4 ℃的2.5 倍，而2 000 mg/L质量浓度的溶液37 ℃条件下产生SEM的量仅为4 ℃的1.3 倍。

图3 浸泡温度对SEM产生量的影响Fig.3 Effects of soaking temperature on the production of SEM

2.4 浸泡时间对鸡爪形成SEM的影响

鸡爪样品中分别定量添加有效氯质量浓度为500、1 000、2 000 mg/L次氯酸钠溶液，在25 ℃考察1、5、8、24 h浸泡时间对SEM产生量的影响，样品平行测定3份，取平均值，结果如图4所示。从图4可知，在浸泡时间8 h以内，鸡爪中产生的SEM产生量随着浸泡时间的延长而增大，在有效氯质量质量浓度为500、1 000、2 000 mg/L条件下，形成SEM产生量分别从浸泡1 h的0.226、0.914、1.960 μg/kg，增加到浸泡8 h的0.364、1.124、2.700 μg/kg；超过8 h以后，产生的SEM产生量基本保持不变。产生该结果的原因在于随着时间的延长，次氯酸钠溶液中的有效氯浓度会逐渐降低，反应产生的SEM产生量越来越少，最终SEM产生量趋于恒定值。

图4 浸泡时间对SEM形成的影响Fig.4 Effects of soaking time on the formation of SEM

2.5 浸泡pH值对鸡爪形成SEM的影响

鸡爪样品中分别定量添加500、1 000、2 000 mg/L次氯酸钠溶液，在25 ℃考察pH值为7、8、9、11、12条件对产生量的影响，样品平行测定3 份，取平均值，结果如图5所示。在浸泡溶液pH值为9～12范围内，鸡爪中形成SEM产生量随着浸泡溶液pH值的升高而增大，有效氯质量浓度为500、1 000、2 000 mg/L的次氯酸钠溶液形成SEM产生量分别从浸泡pH值为9时的0.642、1.259、2.103 μg/kg，增加到浸泡pH值为12的0.789、1.467、4.080 μg/kg。pH值对高质量浓度次氯酸钠浸泡的鸡爪样品影响比较大，其SEM的增加量达到94%；对低质量浓度的影响相对较小，其SEM的增加幅度只有23%。根据Bendall[18]的研究，高pH值有利于SEM的形成，这主要是由于高pH有利于反应中间产物氨基异氰酸的形成，氨基异氰酸再与尿素反应形成SEM。另外，有研究[19-20]表明，pH值对次氯酸钠溶液有效氯的稳定性影响很大，在碱性条件下较稳定，而在较低pH值条件下容易分解，较高pH值有利于保持次氯酸钠有效氯的活性，故SEM的产生量也较高。由图5还可以看出，pH 8.0与pH 9.0条件下产生的SEM产生量较为接近，而pH 7.0时产生的SEM产生量明显比pH 8.0和pH 9.0时的高（高25%以上），其原因有待于进一步研究。

图5 浸泡pH值对SEM形成的影响Fig.5 Effects of soaking pH on the formation of SEM

2.6 浸泡后漂洗对鸡爪形成SEM的影响

分别用有效氯质量浓度为1 000、2 000、3 000 mg/L的次氯酸钠溶液在25 ℃浸泡鸡爪样品1 h，浸泡后考察采用清水漂洗10 s以及不经漂洗两种情况下SEM的残留量的差异，结果如图6所示。从图6可知，次氯酸钠溶液浸泡后用清水漂洗能减少鸡爪中SEM的量。有效氯质量浓度为500、1 000、2 000 mg/L的次氯酸钠溶液形成SEM的量漂洗前后从0.746、1.909、4.116 μg/kg下降到0.319、0.801、2.032 μg/kg，减少量均在50%～60%之间。这说明次氯酸钠处理鸡爪所产生的SEM有较大部分是以游离态的形式存在，通过清水漂洗能够洗掉；同时含残留有一部分SEM是以蛋白质结合态的形式存在，通过清水漂洗无法去除。

图6 浸泡后漂洗对SEM形成的影响Fig.6 Effects of rinsing on the formation of SEM

3 结论

本实验系统探究了不同条件对次氯酸钠消毒剂处理后的鸡爪中SEM产生量的影响，考察的因素包括有效氯浓度、温度、浸泡时间和浸泡溶液的pH值。研究结果表明，温度和有效氯质量浓度越高，产生SEM的量越多；在8 h内SEM的产生量随处理时间的延长而逐渐增大；在浸泡pH 9～12范围内，鸡爪中SEM产生量会随着浸泡液pH值增大而增大；通过漂洗可以除去产生的游离态SEM。该研究结果对于指导食品生产企业控制和减少化学消毒食品中SEM的残留，提高产品的竞争力具有重要参考价值。

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Influence of Disinfection Conditions with Sodium Hypochlorite on Semicarbazide Residue in Chicken Claw

SHEN Jincan1,2, XIE Dongdong3, KANG Haining1,2, ZHENG Zongkun3, ZHAO Fengjuan1,2, WANG Zhiwei3
(1. Food Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China; 2. Shenzhen Key Laboratory of Detection Technology R&D on Food Safety, Shenzhen 518045, China; 3. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China)

This study was concerned with the effect of disinfection with different concentrations of sodium hypochlorite under varying conditions of temperature, soaking time and pH on the generated of semicarbazide residues in chicken claw. After samples were treated with aqueous sodium hypochlorite, the derivatization was carried out with 2-nitrobenzaldehyde in acidic conditions. The semicarbazide in the reaction system was extracted with ethyl acetate after adjusting to neutral pH for analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and quantifi cation by isotope internal standard method. The results showed that effective chlorine concentration, temperature and soaking time each had a signifi cant positive correlation with the yield of semicarbazide in chicken claw. The amount of semicarbazide increased with increasing pH value from 9 to 12. After being rinsed with water, the content of semicarbazide was reduced by 50%–60%.

sodium hypochlorite; disinfection; chicken claw; semicarbazide; conditions

TS207.5

10.7506/spkx1002-6630-201510001

2014-08-05

国家自然科学基金青年科学基金项目(31201444)；深圳市基础研究项目(JC201105190972A)

沈金灿(1978—),男,高级工程师,博士,研究方向为药物残留。E-mail：jincansh@263.net