姜黄素对糖尿病大鼠血脑屏障的影响

（中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳 110021）

姜黄素对糖尿病大鼠血脑屏障的影响

吴晓黎，王智敏，郝颖，梁鹤缤，郑东明，郭阳

（中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳 110021）

目的探讨姜黄素对链脲佐菌素诱导的糖尿病（DM）大鼠血脑屏障（BBB）的作用。方法实验动物分为正常对照组、DM组、DM+姜黄素组，3个月后检测各组大鼠BBB通透性、BBB紧密连接蛋白claudin和occludin的表达，ELISA法检测大鼠皮层白细胞介素（IL）-10、IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的蛋白含量，Western blot法检测各组大鼠核因子κB（NF-κB）的表达。结果姜黄素对DM大鼠的血糖没有显著影响，但可降低DM大鼠的体质量。DM组大鼠BBB通透性显著增加（P＜0.01），claudin和occludin的表达显著降低（P＜0.01），IL-10的表达降低（P＜0.01），IL-6和TNF-α的蛋白含量明显升高（P＜0.01），NF-κB的表达显著增加（P＜0.01）。给予姜黄素可升高claudin和occludin的表达（P＜0.05），降低BBB通透性（P＜0.05），减少IL-6和TNF-α的含量（P＜0.05），提高IL-10的含量（P＜0.05），并显著抑制NF-κB的表达（P＜0.01）。结论应用姜黄素可通过抑制DM诱导的炎性反应，升高claudin和occludin的表达，降低DM大鼠BBB通透性，保护DM大鼠的BBB。其保护作用可能与NF-κB通路有关。

姜黄素；糖尿病；血脑屏障；核因子κB

多年来一直认为糖尿病（diabetes mellitus，DM）与血管病变有关［1］。在脑部，DM导致的血管炎症使血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）结构和功能的完整性受到破坏［2，3］，这与DM脑血管病并发症密切相关。DM对BBB的损伤，造成脑内内环境的紊乱，加重神经元的损伤和死亡，增加神经系统事件的风险。但是DM对BBB的具体调节机制尚不明确。

姜黄素是从姜黄属植物根茎中提取出来的一种酚性色素，具有多方面的药理作用，在基因和细胞信号通路多水平上具有抗炎等药理学作用［4］，对动脉硬化、DM等疾病具有良好的防治作用，已经被医学人员所关注。但其是否对DM的BBB有保护作用尚未见报道。我们应用链脲佐菌素介导的DM大鼠模型，观察姜黄素对BBB结构和功能的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级3月龄雄性SD大鼠，体质量200～220 g，由中国医科大学实验动物中心提供。大鼠分为正常对照组、DM组、DM+姜黄素组。DM大鼠模型制备前大鼠禁食12 h，给予单次腹腔注射溶解于pH 4.0～4.2、浓度为0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液中的链脲佐菌素，剂量为50 mg/kg。正常对照组注入相同剂量生理盐水。注射后所有大鼠放入代谢笼内常规饲养，自由饮食。大鼠血糖持续超过16.7 mmol/L、尿糖试纸（+++）的大鼠被认定为DM大鼠。4周后根据体质量和血糖匹配的原则，将DM大鼠分为DM组和DM+姜黄素组。姜黄素用1%羧甲基纤维素配成混悬液，DM+姜黄素组每日以姜黄素100 mg/kg灌胃，另2组给以等量的羧甲基纤维素，为期8周。

1.2 主要药品与试剂

链脲佐菌素（美国Sigma-Aldrich公司）；1%羧甲基纤维素、伊文思蓝粉剂（evans blue，EB）（美国Fluka公司进口分装）；兔抗claudin多克隆抗体、小鼠抗ocdudin多克隆抗体（美国Zymed公司）；白细胞介素（interleukin，IL）10、IL-6和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；小鼠抗大鼠GAPDH抗体、核因子κ B（nuclear factor κB，NF-κB）单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；SABC试剂盒、DAB显色剂、SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂（北京中山公司）。

1.3 BBB通透性的测定

各组大鼠在手术前2 h股静脉注入2%的EB（2 mL/kg）。然后在相应时间点深度麻醉，自左心室灌注生理盐水300 mL后，断头取脑，按1 mL/100 mg脑组织加入甲酰胺溶液，60℃水浴抽提24 h，用分光光度计在620 nm处测光密度值。作出标准曲线，计算脑组织EB含量（μg/g脑质量）。纯甲酰胺溶液设为空白对照。

1.4 免疫组化法检测claudin和occludin表达变化

3个月后大鼠麻醉，开胸，用生理盐水灌流后4%多聚甲醛灌注固定。取脑置于上述固定液中固定24 h后，再将标本置于30%蔗糖中沉淀24 h。组织块在恒冷切片机上切片。免疫组化操作步骤按照说明书进行。

1.5 ELISA法检测脑组织中IL-10、IL-6和TNF-α的蛋白含量

取IL-10、IL-6和TNF-α ELISA试剂盒，操作步骤按照说明书进行。根据标准品的浓度及对应的光密度值，得到标准曲线及对应的样品浓度。

1.6 Western blot法检测脑组织中NF-κB蛋白表达水平的变化

每组各取5只大鼠颈椎脱臼处死、断头、剥离并取出大脑皮质，称取各组标本100 g，剪碎加入冰预冷的细胞裂解液500 μL，超声粉碎。4℃、12 000 r/min离心0.5 h，取上清。采用酚试剂法测定蛋白浓度。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印，用含5%去脂奶粉的TTBS封闭4℃1 h。一抗（1∶500），4℃过夜。洗膜，并加入碱性磷酸酶标记的二抗（1∶1 000），室温下2 h。TTBS清洗2次，每次5 min；TBS洗1次，5 min。酶显法显色。使用Chemi lmager 5500 V3.0软件进行图像灰度扫描，Fluor Chem 2.0分析软件进行分析，获取目的条带和内参照GADPH的整合光密度值，以两者的比值作为蛋白表达半定量指标。

1.7 统计学分析

所有数据以x±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析和Bonferroni检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量和血糖的比较

DM组大鼠血糖较正常对照组比较显著升高（P＜0.01），体质量显著下降（P＜0.01）。DM+姜黄素组血糖较DM组比较无明显变化（P＞0.05），体质量较DM组明显升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠的血糖和体质量的比较Tab.1 Comparison of blood glucose and weight between each group

2.2 BBB通透性的变化

采用检测EB的渗出量评估BBB通透性的变化。与正常对照组相比，DM组EB的含量明显升高（P＜0.05），DM+姜黄素组EB的含量较DM组显著下降（P＜0.05）。见表1。

2.3 各组脑组织中claudin和occludin的表达情况

免疫组化法检测各组脑组织中claudin和occludin的表达变化。如图1所示，与正常对照组相比，DM组claudin和occludin的表达水平明显降低（P＜0.01）。与DM组相比，DM+姜黄素组claudin和occludin的表达水平明显升高（P＜0.05）。见表2。

图1 各组脑组织中claudin和occludin蛋白的表达Fig.1 Expression of claudin and occludin in brain tissues in each group

表2 各组脑组织中claudin、occludin、IL-10、IL-6、TNF-α和NF-κB含量的变化Tab.2 Changes in expression of claudin，occludin，IL-10，IL-6，TNF-α，and NF-κB in brain tissues in each group

2.4 各组脑组织中IL-10、IL-6和TNF-α的蛋白含量

DM组的IL-10的含量显著低于正常对照组（P＜0.01）；DM+姜黄素组的IL-10含量明显低于正常对照组（P＜0.05），明显高于DM组（P＜0.05）。与IL-10的结果相反，DM组的IL-6和TNF-α含量显著高于正常对照组（P＜0.01）；DM+姜黄素组的IL-6和TNF-α含量明显高于正常对照组（P＜0.05），但明显低于DM组（P＜0.05）。见表2。

2.5 各组NF-κB表达水平的变化

应用Western blot法检测皮层中NF-κB蛋白表达，见图2。与正常对照组相比，DM组的NF-κB显著增加（P＜0.01）；与DM组相比，DM+姜黄素组的NF-κB显著减少（P＜0.01），见表2。

3 讨论

DM破坏BBB的机制非常复杂，目前尚未明确。有人认为DM是一种伴有多种炎性因子激活为特征的自身炎性疾病［5］。中枢神经系统内炎性反应的过度激活可能是DM患者BBB变化的重要机制。姜黄素为姜黄的主要活性成分，近年的大量研究证明姜黄素具较强的抗炎及免疫调节等活性，并且无明显的毒副作用。本研究旨在探讨姜黄素对DM大鼠BBB的改善作用及相关机制。

图2 各组脑组织中NF-κB的表达Fig.2 Expression of NF-κB in brain tissues in each group

本研究通过建立链脲佐菌素诱导的DM大鼠模型并给予姜黄素，观察姜黄素对DM大鼠血糖、体质量的影响。实验发现姜黄素对DM大鼠的血糖无明显影响，但可阻止DM大鼠体质量下降。这与Babu等［6］研究结果相似。

我们通过测定脑组织中EB含量确定各组大鼠BBB通透性的变化。结果显示，DM组EB含量明显升高，BBB通透性增加。免疫组化结果显示，DM组claudin和occludin的表达显著降低，BBB完整性受到破坏。以上结果提示DM显著破坏了BBB的完整性，增加了BBB的通透性。本研究中我们发现，给予姜黄素可显著降低DM组EB的含量，BBB通透性降低，同时显著增加DM组紧密连接蛋白claudin和occludin的表达，与DM组比较有显著差异。与此结果相似，Jiang等［7］发现姜黄素可通过保护局灶性脑缺血大鼠的BBB而起神经保护作用。Sun等［8］证实姜黄素可通过降低脑出血小鼠基质金属蛋白酶，降低BBB通透性，进而改善神经功能。

目前发现与DM相关的炎性因子很多，包括TNF-α［9］、IL-6［10］、IL-1β［11］等。大量研究表明姜黄素具有较强的抗炎作用，Li等［12］发现姜黄素可通过抑制DM大鼠TNF-α从而减轻DM引起的神经性疼痛。本研究结果显示，DM大鼠脑组织中IL-10的含量显著降低，IL-6和TNF-α的含量明显升高。给予姜黄素后，IL-10的含量明显升高，而IL-6和TNF-α含量显著降低。以上结果表明姜黄素具有较强的抗炎作用。

NF-κB广泛地参与炎性反应、免疫反应等多种生物学效应。NF-κB信号通路的失调与很多疾病有关，比如慢性炎症、DM、自身免疫疾病等。调控NF-κB信号通路是治疗炎症、肿瘤及代谢相关疾病的重要策略。研究发现，NF-κB信号通路与DM微血管内皮损伤密切相关。HO等［13］发现高糖激活NF-κB，并进一步诱导人血管内皮细胞死亡。NF-κB的持续激活可能是DM微血管病变、BBB破坏的始动机制之一。近年来研究表明，姜黄素可抑制刺激后NF-κB的活性，从而对多种疾病发挥治疗与预防作用。姜黄素通过抑制NF-κB的活性而产生强大的抗炎作用［14，15］，而且姜黄素还可通过抑制NF-κB抑制蛋白α激酶和蛋白激酶B进而抑制NF-κB的活性［16］。本研究中，Western blot结果显示，DM大鼠NF-κB的表达显著增加。而给予姜黄素后，NF-κB的表达显著降低。说明姜黄素显著抑制了DM大鼠NF-κB的激活。

综上所述，姜黄素对DM大鼠的BBB有保护作用。姜黄素可显著抑制DM大鼠中枢神经系统炎性反应，降低BBB通透性，保护BBB结构和功能的完整性。上述作用与其对NF-κB的抑制作用密切相关。

［1］Carrano A，Hoozemans JJ，van der Vies SM，et al.Neuroinflammation and blood-brain barrier changes in capillary amyloid angiopathy［J］.Neurodegener Dis，2012，10（1-4）：329-331.

［2］Carlsson CM.Type 2 diabetes mellitus，dyslipidemia，and Alzheimer’s disease［J］.Alzheimers Dis，2010，20（3）：711-722.

［3］Taguchi A.Vascular factors in diabetes and Alzheimer’s disease［J］.Alzheimers Dis，2009，16（4）：859-864.

［4］Banerjee M，Tripathi LM，Srivastava VM，et a1.Modulation of inflammatory mediators by ibuprofen and curcumin treatment during chronic inflammation in rat［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2003，25（2）：213-224.

［5］Snell-Bergeon JK，West NA，Mayer-Davis EJ，et a1.Inflammatory markers are increased in youth with type 1 diabetes：the SEARCH Case-Control study［J］.Clin Endocrinol Metab，2010，95（6）：2868-2876.

［6］Babu PS，Srinivasan K.Hypolipidemic action of curcumin，the active principle of turmeric（Curcuma longa）in streptozotocin induced diabetic rats［J］.Mol Cell Biochem，1997，166（1-2）：169.

［7］Jiang J，Wang W，Sun YJ，et al.Neuroprotective effect of curcumin on focal cerebral ischemic rats by preventing blood-brain barrier damage［J］.Eur J Pharmacol，2007，561（1-3）：54-62.

［8］Sun Y，Dai M，Wang Y，et al.Neuroprotection and sensorimotor functional improvement by curcumin after intracerebral hemorrhage in mice［J］.Neurotrauma，2011，28（12）：2513-2521.

［9］李昭，白英龙，姜红堃，等.生长激素释放肽Ghrelin改善自发性糖尿病大鼠血管内皮损伤［J］.中国医科大学学报，2014，43（10）：902-905.

［10］Krogh-Madsen R，Plomgaard P，Keller P，et al.Insulin stimulates interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha gene expression in human subcutaneous adipose tissue［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2004，286（2）：E234-E238.

［11］Mano Y，Anzai T，Kaneko H，et al.Overexpression of human C-reactive protein exacerbates left ventricular remodeling in diabetic cardiomyopathy［J］.Circ J，2011，75（7）：1717-1727.

［12］Li Y，Zhang Y，Liu DB，et al.Curcumin sttenuates diabetic neuropathic pain by downregulating TNF-alpha in a rat model［J］.Int J Med Sci，2013，10（4）：377-381.

［13］Ho FM，Lin WW，Chen BC，et al.High glucose-induced apoptosis in human vascular endothelial cells is mediated through NF-kappaB and c-Jun NH2-terminal kinase pathway and prevented by PI3K/Akt/eNOS pathway［J］.Cell Signal，2006，18（3）：391-399.

［14］Sandur SK，Pandey MK，Sung B，et al.Curcumin，demethoxycurcumin，bisdemethoxycurcumin，tetrahydrocurcumin and turmerones differentially regulate anti-inflammatory and anti-proliferative responses through a ROS-independent mechanism［J］.Carcinogenesis，2007，28（8）：1765-1773.

［15］LoTempio MM，Veena MS，Steele HL，et al.Curcumin suppresses growth of head and neck squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2005，11（19）：6994-7002.

［16］Aggarwal BB，Harikumar KB.Potential therapeutic effects of curcumin，the anti-inflammatory agent，against neurodegenerative，cardiovascular，pulmonary，metabolic，autoimmune and neoplastic diseases［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41（1）：40-59.

（编辑陈姜）

Effectsof Curcumin on Blood-brain Barrier in ExperimentalStreptozotocin-induced Diabetic Rats

WUXiao-li，WANGZhi-min，HAOYing，LIANGHe-bin，ZHENG Dong-ming，GUO Yang
（DepartmentofNeurology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110021，China）

ObjectiveTo study the effect of curcumin on blood-brain barrier（BBB）in streptozotocin-induced diabetes mellitus（DM）rats.MethodsThe rats were divided into 3 groups randomly：the control group，the DM group and the DM+curcumin group.The permeability of BBB and the expressions of tight junction proteins claudin and occludin were detected after 3 months.ELISA analysis was used to detect the expression of interleukin（IL）-10，IL-6 and tumornecrosis factorα（TNF-α）levels.Western blotwas used to determine the expression ofnuclearfactorκB（NF-κB）.ResultsThe weightofDMratswas significantly reduced by curcumin，butblood glucose was notaffected.In the DMgroup，BBB permeability was significantly increased（P＜0.01）；the expression levels of claudin and occludin were significantly decreased（P＜0.01）；the expression levels of IL-6 and TNF-α were significantly up-regulated（P＜0.01）；the expression level of IL-10 was significantly reduced（P＜0.01）；and the expression level of NF-κB was significantly up-regulated（P＜0.01）.Then，administration of curcumin increased the expression of claudin and occludin（P＜0.05），reduced BBB permeability（P＜0.05），decreased the levelofIL-6 and TNF-α（P＜0.05），increased the levelof IL-10（P＜0.05），and significantly inhibited the expression of NF-κB（P＜0.01）.ConclusionCurcumin has protective effects on BBB in DM rats by inhibiting inflammatory reactions induced by DM，increasing the expression of claudin and occludin and reducing BBB permeability in DM rats.The protective mechanism may be associated with the NF-κBchannel.

curcumin；diabetes mellitus；blood-brain barrier；nuclear factor κB

R743.32

A

0258-4646（2015）04-0298-04

国家自然科学基金（81000467）

吴晓黎（1973-），女，讲师，博士. E-mail：77kwuxiaoli@163.com

2015-01-07

网络出版时间：