维生素D及其受体对RIP1调控作用的研究

（中国医科大学代谢病分子机制与药物研究所，沈阳 110001）

维生素D及其受体对RIP1调控作用的研究

刘兵，葛鑫，丁炎，陈允梓，聂宏光

（中国医科大学代谢病分子机制与药物研究所，沈阳 110001）

目的探讨维生素D及其受体对受体相互作用蛋白（RIP）1表达的影响及其作用机制。方法采用实时定量PCR和Western blot技术，检测维生素D刺激对RIP1的mRNA和蛋白表达水平的影响，采用免疫共沉淀的方法探讨维生素D及其受体对RIP1的调节机制。结果维生素D及其受体能够显著降低RIP1的mRNA及蛋白水平表达，抑制HSP90与RIP1复合物的形成。结论维生素D及其受体通过调节HSP90与RIP1的相互作用调控RIP1的表达，为维生素D及其受体抑制肿瘤的发生提供了新的理论依据。

维生素D；维生素D受体；受体相互作用蛋白；热休克蛋白

受体相互作用蛋白（receptor interacting protein，RIP）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以调节核因子κB的活性，是坏死信号通路中关键的调控因子，决定细胞生存和死亡的交叉点［1，2］。目前发现，RIP家族成员RIP1在细胞凋亡、细胞存活及细胞程序性坏死等信号传导中起着关键的作用［3］，而其功能受热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs），泛素化等的调节［4］。维生素D（lα，25-dihydroxyvitamin D3）可以影响多种转录因子的信号通路，目前已有相当多的流行病学研究结果表明，体内维生素D水平与恶性肿瘤的发生或预后呈负相关［5］。维生素D具有抑制肿瘤等生物学功能，但其具体机制尚不明确。本研究通过检测维生素D刺激对RIP1的mRNA和蛋白表达的影响，发现维生素D可以抑制RIP1的表达。进一步的研究表明此作用可能与其抑制HSP90和RIP1复合物的形成有关，这一发现将为维生素D及其受体抑制肿瘤的发生提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纤维细胞株（mice embryonic fibroblasts cells，MEFS）以及VDR-/-MEFS来自美国芝加哥大学Yanchun Li实验室，小鼠成纤维细胞株（mouse fibroblasts cells，L929）购自American Type Culture Collection（ATCC）公司。

主要试剂：DMEM培养基，购自美国HyClone公司；胰酶和胎牛血清，购自美国Cellgro公司；Trizol，购自美国Life Technologies公司；逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒，购自日本TaKaRa公司；维生素D、格尔德霉素来自美国芝加哥大学Yanchun Li实验室；兔抗人RIP1单克隆抗体购于美国Sigma公司；IgG-HSP90、小鼠抗VDR单克隆抗体、小鼠抗β-actin单克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，均购自美国Santa Cruz公司；ECL发光液购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：MEFS细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素（100 μg/mL）、链霉素（100 μg/μL）的DMEM培养基中，于37℃、含有5%CO2+95%O2的湿化气体中孵育贴壁生长传代，每2 d传代1次，更换新鲜培养基。

1.2.2 实时定量PCR检测不同处理组MEFS细胞中mRNA变化：用20 nmol/L维生素D，20 ng/μL肿瘤坏死因子α分别于0、12、24、48、72、96 h 6个时间点处理MEFS细胞，以观察维生素D对其诱导的死亡作用影响。用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA。紫外分光光度法进行准确定量，取500 ng进行逆转录，最后用实时定量PCR仪检测细胞中RIP1的表达量。内参采用GAPDH，RIP1特异寡核苷酸引物为：Forward：5′-AGTCCTGGTTTGCTCCTTCCC-3′；Reverse：5′-GCGTCTCCTTTCCTCCTCTCTG-3′。反应条件为95℃预变性5 min；95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，共40个循环。结果采用比较阈值法进行定量分析。对每一标本计算目的基因的拷贝数并比较。

1.2.3 Western blot检测不同处理组细胞中RIP1蛋白表达的变化：用20 nmol/L维生素D按照不同时间点处理细胞，蛋白裂解法提取蛋白，加热变性后应用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，分离后的蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗为1∶1 000稀释的兔抗人RIP1或β-actin。4℃孵育过夜后用TBST洗膜3次，每次10 min。然后加入二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，1∶2 000稀释。室温孵育1 h，TBST洗膜后与ECL试剂反应。X线片曝光，显影，定影后分析。

1.2.4 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，IP）：细胞在非变性条件下被裂解，完整细胞内存在的蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留。预冷的RIP1A Buffer，protein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有IgG的溶液及RIP1抗体反应后，其上的protein A就能吸附抗原。4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜。加入100 μL Protein A beads来捕捉抗原抗体复合物，混合，离心。收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIP1A buffer清洗。将上样样品煮5 min，以游离抗原、抗体、珠子，离心，将上清电泳，电泳前应再次煮5 min变性，进行Western分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 维生素D对MEFS和L929细胞中RIP1 mRNA表达水平的影响

图1 Real-time PCR检测不同维生素D处理组细胞RIP1m RNA水平的表达Fig.1 Expression levels of RIP1 mRNA with different vitamin D treatment groups by real-time PCR

实时定量PCR结果（图1）显示，随着维生素D（20 nmol/L）诱导时间的增加，RIP1mRNA的表达水平都有所下降。在L929细胞中，4 h抑制效果最明显。并且与0 h RIP1表达水平相比存在明显统计学差异（P＜0.05，n=3）（图1A）。在MEFS细胞中，24 h抑制效果最明显。以0 h RIP1表达水平为100%，12、24、48 h时间点mRNA水平与对照组相比均有明显统计学差异（P＜0.05，n=3）（图1B）。维生素D长时间刺激后，细胞中RIP1mRNA的表达水平呈上升趋势，可能与溶液中维生素D随时间延长而代谢增多，对细胞中RIP1 mRNA的表达抑制能力减弱有关。在VDR敲除的MEFS（VDR-/-）细胞中，RIP1 mRNA的表达水平明显高于野生型（WT）细胞，进一步证实维生素D及其受体对RIP1 mRNA的表达有抑制作用（图1C）。

2.2 维生素D对MEFS和L929细胞中RIP1蛋白表达水平的影响

Western blot结果表明，在L929细胞中，维生素D（20 nmol/L）迅速降低RIP1蛋白表达，2 h最为显著（图2A）。在野生型MEFS细胞中，给予维生素D（20 nmol/L）预处理2 h后，对RIP1的抑制作用与L929细胞相似；而在VDR敲除的MEFS（VDR-/-）细胞中，RIP1蛋白表达水平明显高于野生型（WT）细胞，进一步证实维生素D及其受体对RIP1的蛋白表达有抑制作用（图2B）。

图2 Western blot检测不同细胞系RIP1蛋白水平的表达Fig.2 Expression of RIP1 protein in different stable cell lines by Western blot

2.3 维生素D对RIP1与HSP90相互作用的调控

为探索维生素D调控RIP1表达的作用机制，本研究采用免疫共沉淀方法检测了RIP1与HSP90的相互作用。结果显示，维生素D（20 nmol/L，2 h）预处理的MEFS细胞中，HSP90与RIP1结合条带明显弱于对照组，说明维生素D的刺激抑制了HSP90-RIP1复合物的形成（图3A）。进一步的实验结果显示，随着格尔德霉素（geldanamycin，GA）（HSP90的特异性功能抑制剂）不同剂量预刺激2 h后，RIP1的表达量呈现剂量依赖的下降；并且VDR缺失的MEFS细胞中给RIP1的表达量下降更加显著，表明维生素D受体的缺失促进了GA破坏HSP90-RIP1复合物的稳定性（图3B）。

3 讨论

图3 维生素D及其受体对RIP1和HSP90的相互作用的影响Fig.3 Detection of vitamin D and its receptor for RIP1 and HSP90 interaction.

RIP1是肿瘤坏死因子α信号通路的重要组成部分，通过非降解的泛素链快速且稳定地募集肿瘤坏死因子受体。肿瘤坏死因子α依赖RIP1激活核因子κB［6］。核因子κB是促细胞存活的重要信号效应分子，调控细胞生长、存活、组织和器官发育以及系统的免疫反应等，与多种人类疾病密切相关［7］。核因子κB的持续活化是肿瘤细胞生长的重要原因［8］。缺乏RIP1的细胞对肿瘤坏死因子α诱导的死亡高度敏感，可能与缺乏RIP1而不能激活存活转录因子核因子κB有关。因此，RIP1与肿瘤的发生密切相关。临床研究表明，较低的维生素D水平是导致多种癌症发生的重要因素，维生素D能够降低多种癌症的死亡率［9］，如结肠癌、直肠癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等。维生素D抑制肿瘤的机制尚不清楚，我们推测维生素D的上述作用可能与RIP1相关。

在本研究中我们应用不同细胞株检测了维生素D对RIP1mRNA及蛋白表达水平的影响，结果显示维生素D及其受体能够显著降低研究凋亡经典细胞系MEFS中RIP1 mRNA及蛋白水平表达，其他细胞系如小鼠成纤维细胞L929，人结肠癌细胞HT-29，人乳腺癌细胞MCF-7等，作用均与其相似，即维生素D及其受体对RIP1的表达具有抑制作用。

HSP是包括RIP1在内的很多蛋白激酶的伴侣蛋白，HSP的主要作用是参与已获得三级结构的蛋白质的激活与成熟过程［10］。根据同源程度和分子量的大小，可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP和泛素等几个家族，其中，HSP90在多种肿瘤组织中表达较高，与细胞内信号转导通路中的信号蛋白相互作用，维持这些蛋白的正常结构与功能，在肿瘤的发生发展中起重要作用［11］。HSP90可以和RIP1形成复合物，稳定RIP1，使其避免被溶酶体降解。在本研究进一步探讨维生素D及其受体对RIP1的表达具有抑制作用的机制过程中，我们发现维生素D可以抑制HSP90与RIP1的结合。格尔德霉素属于苯醌安莎霉素类抗生素，作为HSP90的特异性功能抑制剂，会导致RIP1的降解，破坏HSP90与RIP1的相互作用［12］，我们的研究表明在VDR缺失的细胞中这种降解作用更显著，进一步证实VDR可能参与了HSP90与RIP1的相互作用。

本研究结果揭示维生素D及其受体对RIP1的表达具有下调作用，并且表明其作用机制与影响HSP90与RIP1的相互作用有关。这将为我们深入了解维生素D及其受体对肿瘤的作用机制提供新的思路，对于某些恶性肿瘤应用维生素D进行选择性的诱导肿瘤细胞程序性死亡可能起到潜在的治疗效果。

［1］Christofferson DE，Li Y，Hitomi J，et al.A novel role for RIP1 kinase in mediating TNFα production［J］.Cell Death Dis，2012，3：e320.

［2］Galluzzi L，Kepp O，Kroemer G，et al.RIP kinases initiate programmed necrosis［J］.J Mol Cell Biol，2009，1（1）：8-10.

［3］O′Donnell MA，Ting AT.RIP1 comes back to life as a cell death regulator in TNFR1 signaling［J］.FEBS J，2011，278（6）：877-887.

［4］Meylan E，Burns K，Hofmann K，et al.RIP1 is an essential mediator of Toll-like receptor 3-induced NF-kappa B activation［J］.Nat Immunol，2004，5（5）：503-507.

［5］Wang Y，Zhu J，DeLuca HF.Where is the vitamin D receptor?［J］Arch Biochem Biophys，2012，523（1）：123-133.

［6］Festjens N，Vanden Berghe T，Cornelis S，et al.RIP1，a kinase on the crossroads of a cell′s decision to live or die［J］.Cell Death Dif-fer，2007，14（3）：400-410.

［7］Sun SC，Liu ZG.A special issue on NF-κB signaling and function［J］.Cell Res，2011，21（1）：1-2.

［8］Peterlik M，Grant WB，Cross HS.Calcium，vitamin D and cancer［J］.Anticancer Res，2009，29（9）：3687-3698.

［9］Wajant H，Scheurich P.TNFR1-induced activation of the classical NF-κB pathway［J］.FEBS J，2011，278（6）：862-876.

［10］Lin Y，Devin A，Rodriguez Y，et al.Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis［J］. Genes Dev，1999，13（19）：2514-2526.

［11］Ea CK，Deng L，Xia ZP，et al.Activation of IKK by TNFalpha requires site-specific ubiquitination of RIP1 and polyubiquitin binding by NEMO［J］.Mol Cell，2006，22（2）：245-257.

［12］Lewis J，Devin A，Miller A，et al.Disruption of hsp90 function results in degradation of the death domain kinase，receptor-interacting protein（RIP），and blockage of tumor necrosis factor-induced nuclear factor-kappaB activation［J］.J Biol Chem，2000，275（14）：10519-10526.

（编辑裘孝琦）

Study on the Regulation ofRIP1 by Vitamin Dand Vitamin DReceptor

LIU Bing，GEXin，DINGYan，CHENYun-zi，NIE Hong-guang
（Institute ofMetabolic Disease Research and Drug Development，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveReceptor Interacting Protein（RIP）is a crucial regulator in the signaling pathway of necrosis.This study aimed to investigate the effects of vitamin D and vitamin D receptor on the expression of RIP1 and to explore the underlying mechanism.MethodsThe expression levels of RIP1mRNA and protein were detected by real-time quantitative PCR and Western blot.Then the co-immunoprecipitation assay was performed to detect the interaction between vitamin D，vitamin D receptor and RIP1.ResultsVitamin D and Vitamin D receptor significantly reduced the transcription and expression levels of RIP1，and repressed the formation of the HSP90 and RIP1 complex.ConclusionVitamin D and vitamin D receptor could regulate the expression of RIP1 by regulating the interactions between HSP90 and RIP1，which provides a new theoretical basis for suppression ofthe occurrence oftumors by vitamin Dand itsreceptor.

vitamin D；vitamin D receptor；receptor interacting protein；heat-shock protein

Q255

A

0258-4646（2015）04-0289-04

国家自然科学基金（81270098；81371759）

刘兵（1990-），女，硕士研究生.

聂宏光，E-mail：niehg@hotmail.com

2014-10-17

网络出版时间：