登革热病毒快速检测NS1抗原和IgG/IgM抗体的临床应用评价

石亚玲，赵 蓉，黄颖怡

(广州市第八人民医院检验科，广东广州510060)

登革热病毒(Dengue virus，DENV)属黄病毒 科，是影响全球公共卫生的蚊传播病原体。病毒基因编码3个结构蛋白(E、C、M)和7个非结构蛋白 (NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和NS5)，根据包膜蛋白E抗原性可分为4种血清型(DENV-1～4)。该病毒通过感染性伊蚊叮咬向人类传播。全球有100多个国家和地区曾发生过登革热，亚洲东南部是登革热高发区，例如我国广东等东南部省市[1]。2014年广东省登革热的暴发性流行已造成3万多人感染，6人死亡，使登革热的防治重新受到人们重视。登革热的典型特征是高热、白细胞减少和血小板降低等，严重者会造成患者多组织或器官出血，甚至出现登革出血热或登革休克综合征。所以对疑似DENV感染患者快速准确的诊断不仅能够迅速隔离感染源，而且可以对患者及时治疗，使登革热的危害降到最低。目前国际上诊断登革热的实验室方法主要是病毒检测、病毒基因检测、病毒抗原检测和血清学检测4种方法，但往往耗时，有的需要昂贵的仪器设备和繁琐的操作技术[2]。国内也已经有快速简便的胶体金免疫层析法 (gold immunochromatographic assay，GICA)检测试剂盒，但尚未获得批文。我们用GICA检测发热患者DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗体，将检测结果与聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)-荧光探针法的结果进行比较。

材料和方法

一、材料

1.研究对象 2014年8至11月广州市第八人民医院就诊的发热患者血清样本2 633例，患者年龄7个月～83岁，其中男1 327例，女1 306例。健康体检人群样本50例，流行性出血热抗体阳性样本5例，风疹/麻疹抗体阳性样本4例。

2.试剂 DENV核酸检测试剂由中山大学达安基因股份有限公司生产;DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗体检测试剂由广州万孚生物技术股份有限公司生产。

二、方法

采集患者血清，对样本即时进行检测，严格按照试剂盒说明书进行操作。2 633例患者样本均采用PCR-荧光探针法检测DENV核酸。将2 633例患者样本分为3组并采用GICA对DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗体进行检测:Ⅰ组为948例样本，仅检测NS1抗原;Ⅱ组为1 156例样本，仅检测IgG/IgM抗体;Ⅲ组为529例样本，同时检测NS1抗原和IgG/IgM抗体。另50名健康体检人群样本、5例流行性出血热抗体阳性样本、4例风疹/麻疹抗体阳性样本为Ⅳ组，采用GICA检测NS1抗原和IgG/IgM抗体。

三、统计学方法

实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用配对χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Ⅰ组检测结果

DENV NS1抗原检测与PCR的阳性符合率为 89.09%(645/724)，阴性符合率为 92.41%(207/224)，总体符合率为 89.87%(852/948)。NS1抗原检测结果与PCR检测结果间差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 948例样本检测病毒核酸和NS1抗原的结果

二、Ⅱ组检测结果

DENV IgG/IgM抗体检测与PCR的阳性符合率为64.68%(663/1 025)，阴性符合率为66.41%(87/131)，总体符合率为 64.88%(750/1 156)。IgG/IgM抗体检测结果与PCR检测结果间差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表2 1 156例样本检测病毒核酸和IgG/IgM抗体的结果

三、Ⅲ组检测结果

DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗体检测与PCR的阳性符合率为93.56%(392/419)，阴性符合率为61.82%(68/110)，总体符合率为86.96%(460/529)。NS1抗原及IgG/IgM抗体检测结果与PCR检测结果间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 529例样本检测病毒核酸和NS1抗原和/或IgG/IgM抗体的结果

对419例PCR-荧光探针法检测DENV核酸阳性的样本，采用GICA联合检测NS1抗原及IgG/IgM抗体，抗原和抗体相互间的结果为:NS1抗原阳性样本357例，IgG/IgM抗体阳性样本265例，NS1抗原阳性和/或IgG/IgM抗体阳性样本392例。见表4。NS1抗原阳性率为85.20%(357/419)，IgG/IgM 抗体阳性率为 63.25%(265/419)，NS1抗原和/或IgG/IgM抗体阳性符合率为93.57%(392/419)。

表4 419例DENV核酸阳性样本检测NS1抗原和/或IgG/IgM抗体的结果

四、Ⅳ组检测结果

采用GICA联合检测NS1抗原及IgG/IgM抗体，检测结果均为阴性，特异性为100%。

讨 论

DENV感染是一种系统性和功能性疾病。病毒感染后潜伏期为1～14 d，一般为5～9 d。潜伏期后病情变化迅猛，随后进入3个时期:急性发热期、极期和恢复期[3]，可引起一系列的临床症状。虽然目前没有针对DENV特效的抗病毒药物，但是感染者往往在及时的诊断和合理的对症治疗后能够康复。所以，无论是从感染者及时得到合理治疗，还是从第一时间隔离传染源出发，首先就要求临床实验室能够提供快速、准确的检测结果，以供临床诊断参考。

目前针对DENV检测的实验室4种诊断方法各具优势及局限性。病毒检测主要是通过将患者样本接种于蚊虫细胞(如c6/36和AP61细胞系)或乳鼠内共培养后使样本内病毒进入蚊虫细胞或小鼠体内从而达到病毒分离的目的。这种方法特异性高，能够对感染进行确定性诊断，并且还能够确定病毒血清型，但这种方法耗时长、价格高，对样本和实验设备也有特定要求，在普通临床实验室中较难实现[4]。病毒基因检测则是通过PCR对样本内的病毒基因进行扩增后检测，这种方法具有很高的敏感性和特异性，能够在24～48 h内完成检测，但这种方法很可能受到样本中其它基因的干扰而出现假阳性现象[5]，需要专业知识和贵重实验室设备，价格昂贵，上述2种方法都无法区分初次和二次感染。抗原检测主要是用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)针对病毒中NS1抗原检测，这是相对与病毒分离和基因检测方法较为方便、快速的方法，但其敏感性和特异性均不理想，许多研究已经报道ELISA法检测NS1的效应[6]。血清学检测是对感染者体内的IgM、IgG抗体进行检测，可区分初次和二次感染。IgM抗体是初次感染者体内出现的主要抗体，在感染者发热的第3～5天可出现，至第10～20天99%的患者都可以检测到IgM抗体[7];IgG则是二次感染者体内出现的主要抗体，所以IgG检测可以用来判断患者是初次感染还是再次感染。目前对IgM、IgG的检测仍以ELISA为主，国外已有检测IgM的包括微粒凝集法和横向层析试纸条在内的快速检测方法，并且可以针对不同血清型进行检测，但国内均未获得药监局批文。目前国外检测IgM的快速胶体金的敏感性为21% ～99%，特异性为77% ～98%，与之相比，本研究所选用的DENV IgM、IgG检测板敏感性居中而特异性偏低。但国外IgM试剂的敏感性和特异性是以ELISA为标准计算而来，我们是以基因检测法为标准计算而来，所以若要比较国内外DENV检测试剂的效能仍需进一步研究。

本研究结果显示，GICA检测NS1抗原试剂对DENV的检测效能比核酸技术差，但优于IgM、IgG抗体的检测。究其原因，与核酸技术相比GICA使用的是免疫学的抗原抗体反应，免疫技术本身的局限性决定了其检测的敏感性和特异性不如核酸检测技术;与IgM、IgG抗体检测试剂相比，两者同样使用的是抗原抗体反应原理，但NS1在感染者体内是相对单一的抗原[6]，且与NS1抗原反应的抗体是单克隆抗体，而感染者体内的IgM、IgG抗体多样性决定了其交叉反应性的存在，致使GICA检测IgM、IgG抗体的效能降低。

虽然NS1抗原试剂的效能优于IgM、IgG抗体试剂，但是DENV的IgM、IgG抗体检测能够一定程度上说明感染者是首次感染或二次感染，所以抗原检测也不能够完全替代抗体检测。最佳方案则是将抗原和抗体检测结合应用，不仅能够快速确诊患者是否为DENV感染者，还能对其病程有一定提示。故我们将NS1抗原检测和IgM、IgG抗体检测联合应用后与核酸诊断进行比较，发现NS1抗原和IgG/IgM抗体联合检测的阳性符合率为93.56%，差异无统计学意义(P＞0.05)。

本研究使用该试剂对流行性出血热抗体阳性样本、风疹/麻疹抗体阳性样本及健康人群样本进行检测，特异性为100%，说明该试剂对检测NS1抗原和IgG/IgM抗体结果无影响。

准确、快速的床边诊断一直是临床实验室技术发展的方向。本研究结果显示，GICA检测NS1抗原和IgG/IgM抗体具有较高的敏感性和特异性，联合应用能够为临床提供快速、准确的检测结果。但这2种试剂都不能够对DENV血清型进行分型，这将不利于临床对登革热感染者病情预后的判断，尤其是对DENV血清型为Ⅱ型的患者。我们只是初步分析这2种试剂的诊断效能，若要对其进行全面评估则还需要通过更多的样本检测统计和效能评价指标，希望自主研发试剂能够更快、更好的发展，以推动我国乃至全球实验室诊断技术的发展。

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[3]国卫发明电〔2014〕66号.登革热诊疗指南(2014年第2版)[S].

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[5]LEVI JE，TATENO AF，MACHADO AF，et al.Evaluation of a commercial real-time PCR kit for detection of Dengue virus in samples collected during an outbreak in Goiania，Central Brazil，in 2005[J].J Clin Microbiol，2007，45(6):1893-1897.

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