应用EP7-A2文件评价免疫比浊法测定D-二聚体抗脂浊能力

聂 滨，陶天陆，黄 涛，肖华勇

(宜宾市第二人民医院检验科，四川宜宾644000)

D-二聚体作为纤维蛋白溶解过程中一种特异性降解产物[1]，具有高度敏感性和极佳的阴性预期值，已作为血栓性疾病的首选筛选实验。免疫比浊法是测定D-二聚体的推荐方法[2]，但免疫比浊法易受脂血干扰。为了解脂血对免疫比浊法测定D-二聚体的干扰程度，我们按EP7-A2文件要求评价了D-二聚体免疫比浊法。

材料和方法

一、仪器和试剂

BE-X血凝仪;上海太阳生物技术有限公司D-二聚体测定试剂盒(批号:4042035);日立7600-020全自动生化仪;120 000浊度乳糜干扰试剂和测定甘油三酯的试剂均由迈克公司提供。检测均在检测系统质控合格后进行。

二、基础标本准备

取实验当天高D-二聚体浓度新鲜血浆(无脂血、溶血和黄疸)制备1.668 mg/mL混合血清，甘油三酯浓度为0.52 mmol/L。

三、配对差异实验

1.标本准备 (1)基础标本制备方法同前，D-二聚体浓度为1.668 mg/mL;(2)储存液:将干扰试剂用2 mL蒸馏水复溶后作为储存液;(3)测试标本和对照标本:依EP7-A2文件要求，储存液∶基础标本=1∶19制备测试标本，对照标本用蒸馏水补足。测试标本乳糜浊度为1 200，甘油三酯浓度为3.52 mmol/L。

2.重复测定次数的确定 计算最大允许干扰值Dmax与批内标准差(s)的比值，然后查 Dmax/s与重测次数对应表[3]，可得出分析物浓度水平重复测定次数。s通常由基础样本重复测定10次计算可得;Dmax为各项目临床意义差别的标准，本实验的Dmax为10%(由D-二聚体试剂盒提供)。

3.检测要求 按交互的顺序检测测试标本(C)和对照标本(T)。如 C1T1C2T2C3T3...CnTn。如果检测系统受携带污染影响，增加额外的标本使对照标本免受来自测试标本携带污染的影响，增加的额外对照标本结果应舍弃。如C1T1CxCxC2T2CxCxC3T3...CxCxCnTn。

4.进行数据分析 (1)计算观察到的干扰效应的“点估计”，即dobs，是测试标本均值和对照标本均值之间的差值。dobs=Interference=test－connol;(2)计算cut-off值dc(双侧检验)。

dnull是无效假设规定的值，通常为0，对于单侧检验，用 Z1－取代 Z1－/2，Z1－/2查表[3]结果为1.960。

四、干扰剂量效应实验

1.标本准备 (1)基础标本和储存液:同配对差异实验;(2)高浓度标本(H):用基础标本稀释储存液，制备成所需的浓度;(3)低浓度标本(L):低浓度标本的制备可参照基础标本的制备方法;(4)测试标本:制备一系列不同浓度的干扰测试标本，通常5个浓度足够确定一个线性的剂量效应关系，其配置要求为L、75%L+25%H、50%L+50%H、25%L+75%H、H。分别测量这5种浓度的D-二聚体和甘油三酯值。

2.重测次数的确定 通常为3次。

3.检测要求 在同一分析批之内检测5个标本的浓度，第1组按照升序测定各标本，第2组按降序测定，第3组按照升序测定。

4.剂量效应分析 (1)线性效应:如果数据随机分布，成一条直线，可用最小二乘法进行回归分析，确定其斜率、截距、标准误(每个点而非平均值)，在图上绘制平均线;(2)非线性效应:如各浓度水平干扰不是一个线性函数，绘图时显示是弯曲的，则利用非线性二次多项式公式计算给定的干扰物浓度的干扰度。

结 果

一、配对差异实验

1.重测次数的确定 基础标本10次测定的D-二聚体浓度分别为:1.650、1.660、1.661、1.642、1.661、1.712、1.660、1.664、1.689 和1.681，均值和标准差分别为 1.668 和 0.020 5;Dmax为0.1，s为分析物浓度水平的 Dmax/s＞3，查表可知，重测次数为3次。

2.干扰效应结果 利用BE-X血凝仪检测D-二聚体浓度，对照标本结果为 1.634、1.569 和1.627，均值和标准差分别为1.610 和0.035 7;测试标本结果为 1.531、1.482 和 1.521，均值为1.511;1 200 浊度时，dobs=0.099 ＞ dC=(0+0.035 7×1.96)/1.732=0.040 4，表明乳糜1 200浊度对D-二聚体浓度检测有负干扰。

二、计量效应实验

1.重复测定次数 按EP7-A2文件通用要求本研究每个浓度水平重复测定次数为3次。

2.计量效应分析 按干扰物在血清中影响实验的最高浓度水平对贮存液进行相应稀释后，乳糜最高干扰物浓度(H)为4 800浊度，甘油三酯14.04 mmol/L。对结果产生负干扰，干扰效果见表1，线性方程为 Y=1.682 －0.000 974 5 X，计量效应回归分析图见图1。

表1 不同乳糜浓度对D-二聚体测定干扰影响(mg/mL)

图1 乳糜对D-二聚体测定剂量效应图

讨 论

目前，D-二聚体检测方法多种多样，免疫比浊法已被美国食品药品管理局批准用于肺栓塞、深静脉血栓性疾病排除诊断方法，该方法除简便快速、满足急诊需要外，还能定量测定，具有较高的敏感性和阴性预测值、较好的重复性和特异性[2]，但免疫比浊法易受脂血干扰。

EP7-A2[3]文件为我们提供了干扰实验方案，当配对差异实验提示有干扰时，利用剂量效应实验进一步确定不同浓度水平干扰度。本研究用迈克公司提供干扰试剂盒，配对差异实验结果显示，dobs=0.099 ＞dc=0.040 4，表明乳糜 1 200 浊度对D-二聚体免疫比浊法检测有负干扰。剂量效应回归分析实验结果表明，乳糜≤4 800浊度时，分析物浓度水平的剂量效应回归方程均为一次线性负干扰。线性回归方程为 Y=1.682－0.000 974 5X，r=0.980，说明线性好，用该回归方程可准确计算出有乳糜干扰时D-二聚体的含量，为高血脂患者正确评价栓塞性疾病提供依据。

我们曾在配对差异实验中选择D-二聚体为0.35 mg/mL进行研究，发现加入干扰物引起浓度变化小，不能判断是干扰物原因还是精密度原因，故本实验选择较高分析物浓度实验。我们干扰物浓度范围为0～4 800浊度，相当于甘油三酯0.52 ～14.04 mmol/L，这个范围是临床常见的血脂范围，使实验结果对临床有指导意义。

总之，用EP7-A2评价乳糜对D-二聚体免疫比浊法检测存在线性负干扰，该干扰在严格做好标本的采集，运送，保存及抗凝剂选择的质量控制下，建议对高浊度标本进行甘油三酯浓度检测并根据计量效应曲线进行校正来最大程度的消除脂血对D-二聚体浓度的影响。

[1]吴利，周才，黄瑞玉，等.正常孕妇血浆 D-二聚体的检测与分析[J].检验医学，2014，29(10):992-994.

[2]孙学青，韩景银，刘兆军.D-二聚体的临床应用[J].检验医学与临床，2013，2:204-205.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Interference testing in clinical chemistry[S].EP7-A2，CLSI，2005.