MSTN抗体联合中强度爬梯抗阻运动对IR大鼠脂代谢的影响

刘晨涛，王旭丹，唐 量

(1.西北大学体育部，陕西西安 710069;2.陕西师范大学体育学院，陕西西安 710062)

运动作为降低体脂最安全有效的方法一直被 国内外学者所关注。目前研究表明，作为运动主要的两种方式，抗阻力运动较有氧运动对促进体质代谢效果更佳而成为研究热点，张献辉等［1］研究发现抗阻运动能有效增加IR患者肌力，减少脂肪组织，调控血糖水平效果;Kraemer W J等［2］通过控制饮食对比有氧和抗阻训练对脂代谢的作用，结果发现12周抗阻力训练后，机体脂代谢作用较有氧训练高出19%;Cauza E等［3］对10例2型糖尿病患者进行为期4个月的抗阻和有氧运动训练，结果显示抗阻力运动组血脂TC，TG，LDL等指标下降幅度大于有氧运动组。研究表明，高强度较低强度抗阻运动对血糖和HbA1c水平控制效果更好［4］，但由于一般IR人群身体条件较差，所以普遍采用中等强度(50% ～60%自体重)抗阻运动方式。

MSTN是骨骼肌生长发育的主要负调因子之一，其基因失活或突变会导致“双肌”出现［5］。目前大量研究报道MSTN与脂代谢之间的密切关系，如 N K LeBrasseur［6］研究表明，抑制 MSTN 表达对降低体内脂肪以及改善2型糖尿病都有很好的作用。在临床实验中将MSTN抗体用于骨骼肌生长不良患者中，结果表明，MSTN抗体具有安全性以及可行性，因此我们提出假设能否让运动与药物二者共同干预胰岛素大鼠体脂代谢，即选择中强度抗阻运动联合MSTN抗体共同干预，观测其是否能更好地促进IR大鼠体脂代谢。此外Bueno［7］曾研究表明，运动后MSTN表达在骨骼肌和脂肪中的表达水平均会显著性降低，Santos在8周的不同强度的抗阻力训练中研究发现，MSTN抑制剂蛋白都明显升高［8］，因此推测抗阻力运动是否是通过降低MSTN含量表达，也是本次研究关注的另一个方向。

1 材料与方法

1.1 MSTN抗体的制备

在上海生工有限公司合成Myostatin原核基因表达载体，后将重组质粒pQE-Ms转染大肠杆菌表达，提纯MSTN蛋白。

1.2 实验对象与分组

健康雄性SD大鼠50只，8周龄、体重为180～200g，购自于西安交通大学动物中心(陕医动证字:08-004号)。适应性喂养1周后随机挑选10只分为正常对照组(NC组)，剩余40只为高脂膳食组(HF组)随机分为高脂对照组(HFC组)、高脂抗体对照组(HF+MsAb组)、高脂中强度爬梯抗阻力运动(HF+MRT组)，共5组，每组10只。NC组用普通饲料喂养，HF组参考 Heinemeier［9］配制的高脂饲料喂养(基础饲料55%，牛油25%，蛋黄粉15%，其他5%)饲养环境为高度清洁，自然光照，大鼠自由饮水和取食，室温22℃ ～26℃，相对湿度50%左右。

1.3 运动方案与取材

8周高脂膳食后通过口服葡萄糖耐受实验(Oral glucose tolerance test，OGTT)和胰岛素敏感性测试(Insulin sensitivity tests，IST)评价［10］IR 模型的建立，然后将HF组的IR大鼠分别进行相应的干预治疗。中强度抗阻力爬梯(爬梯专利号:201020279841.8)［11］运动负荷组第1周为30%自体重，之后每周按60%自体重，每周3天，每天3组，每组10次，组间休息5min，每次间隔1min(图1)［12］;MSTN抗体组注射剂量为40mg/kg体重，10d/次，共4次;MSTN抗体与爬梯抗阻力联合干预是将二者干预方式相结合。

待8周干预结束后禁食12h取材:用无菌的试管收集血，放在37℃恒温水浴锅中水浴30min使血液凝固后挑去血块，在4℃离心机中3 000 r/min*15min，抽取上清液，标记好后分装，在-80℃冰箱内冻存待测。

图1 大鼠中强爬梯负重训练图Fig.1 Rats in the medium ladder resistance training

1.4 大鼠血脂指标分析

血清中胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、游离脂肪酸(FFA)等按试剂盒中的实验步骤进行操作测定。

1.5 主要试剂

主要试剂:南京建成生物公司 TC，HDL，LDL，TG，FFA等生化试剂盒。

1.6 统计与分析

实验数据均采用SPSS17.0统计软件进行处理，实验结果均以平均数±标准差(±S)表示。采用One-Way ANOVA进行分析，显著性水平选择p＜0.05和p＜0.01水平。

2 实验结果

2.1 MSTN抗体制备结果

实验成功制备效价为1∶10 000 MSTN特异性抗体(图2)。通过用WB、免疫组化等技术鉴定了其特异性，制备后的抗体存放至-20℃冰箱以备后用(图3，4)。

图2 MSTN抗体的制备Fig.2 The preparation of MSTN antibody

图3 MSTN抗体过蛋白A柱WB图Fig.3 WB of MSTN antibody

2.2 IR建模结果

8周高脂膳食后通过OGTT测试表明:NC组和HF组在灌胃葡萄糖后30min，HF组血糖显著高于NC组(p＜0.05)，NC组在60min，90min血糖逐渐下降，120min基本恢复到正常。HF组在60min出现峰值之后血糖也逐渐下降，在120min保持较高的血糖水平。HF组血糖在60min，90min，120min水平较NC组都有显著性差异(p＜0.01)。因此，OGTT结果可以证明，大鼠IR模型建立成功。IST测定结果表明:NC组在注射胰岛素后30min，60min，90min血糖持续下降，较 HF组具有显著性差异(p＜0.01)，NC组、HF组在90min后血糖开始回升。HF组血糖降幅较小，说明高脂膳食大鼠胰岛素敏感性下降。因此，IST结果也证明了IR模型的成功建立。

图4 MSTN抗体免疫组化Fig.4 Immunohistochemistry of MSTN antibody

2.3 血脂指标结果

取各组大鼠血清，测定大鼠TC，HDL，LDL等指标，结果表明:HFC组与NC组相比TC，HDL，LDL含量增高，分别具有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01);与HFC组大鼠相比，MSTN抗体、抗阻中强度以及二者联合都使得大鼠TC，LDL含量降低，部分指标有极显著性差异(p＜0.01);与HF+MsAb组相比HF+MsAb+MRT组HDL血脂指标含量增高并具有显著性差异(p＜0.05)，LDL指标较HF+MsAb组和HF+MRT组相比均有降低，具有显著性差异(p＜0.05)(图5)。

TG，FFA实验结果表明:与NC组相比，HFC组TG，FFA含量显著性增高(p＜0.01);干预组结果表明，HF+MsAb+MRT组与HF+MsAb组及HF+MRT组相比TG指标有明显下降，其中与HF+MRT组具有差异(p＜0.05)，运动联合抗体组与HF+MsAb组及HF+MRT组FFA指标相比较明显下降，并与二者均具有极显著性差异(p＜0.01)(图6)。

3 讨论

研究表明，MSTN基因敲出可使机体能量代谢增加［13］，降低体脂含量，但有关MSTN蛋白活性抑制剂对改善体脂方面的文献报道较少。本实验在前人研究的基础上研制MSTN抗体，以达到抑制MSTN蛋白活性促进脂质代谢的作用。结果表明，本实验成功地制备了效价为1∶10 000 MSTN抗体，经WB和免疫组等检测满足后续实验要求。通过分析不同方式干预大鼠血脂的指标发现，MSTN抗体组总胆固醇含量较HFC组下降了22%，效果显著;与胆固醇代谢密切相关的指标是HDL和LDL，实验结果发现MSTN抗体组较HFC组 HDL含量升 14.8%，LDL含量下降9.2%，表明了MSTN抗体对胆固醇代谢的良好效果，并有效降低了心血管疾病的发生。TG是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是机体含量最多的脂类，FFA是由脂肪分解后的供能物质，这两个指标升高会导致组织对葡萄糖的摄取减少，会加重IR的发展［14］，本研究结果发现MSTN抗体组较HFC组 TG含量下降19.3%，FFA下降0.09%，效果显著，基于这些研究结果，我们可以证明MSTN抗体对改善脂代谢的良好作用。此外，有关文献也报道了抗阻力运动对改善机体成分有良好的作用，Ryan AS［15］，Gaddam KK 等［16］的研究结果不仅表明抗阻运动使机体有效增加瘦体重，提高肌肉体积及横断面积，而且对机体代谢糖原、甘油三脂和蛋白质等能源物质有显著的效果，从根本上降低代谢紊乱的状态。本实验选用中等强度抗阻力爬梯运动，经过8周干预，与HFC组相比较，研究结果发现中强度抗阻运动组显著改善高脂大鼠体血脂指标，其中FFA下降8.1%具有显著性差异(p＜0.05)，表明了中强度抗阻力运动对降低IR大鼠体脂的良好效果。

图5 大鼠血脂指标TC，HDL，LDL变化Fig.5 The changes of TC，HDL，LDL in different groups

图6 大鼠血脂指标TG，FFA变化Fig.6 The changes of TC，HDL，LDL in different groups

有关如何促进体脂代谢的研究非常多，有运动疗法或药物疗法。但是，运动联合药物改善体脂代谢的很少，抗阻力联合药物对改善体脂的研究更是没有。本实验在此思路上选择了MSTN抗体联合抗阻运动对IR患者脂质改善研究，实验结果如实验前提出的假设，运动联合药物对促进体脂代谢出现了效果叠加，为治疗IR患者改善脂质代谢提供了新的思路和实验依据。此外，在现有研究基础上，我们推测抗阻力运动是否通过抑制MSTN分子来降低体脂含量，王静等［17］曾研究抗阻力运动能够通过抑制MSTN表达，而本实验结果中得到了抗阻力运动与MSTN抗体联合后效应叠加，且MSTN抗体组较中强抗阻运动组对IR大鼠体脂改善的更加明显，说明存在抗阻运动通过抑制MSTN而促进脂代谢的这种可能性，而抗阻运动是否通过抑制MSTN的信号分子或参与MSTN信号蛋白干预脂代谢的影响等还不清晰，需要后续实验对分子机制做进一步的研究论证。

4 结语

中强度爬梯抗阻运动和MSTN抗体对高脂胰岛素抵抗模型大鼠的脂质代谢均有较好的改善作用，二者联合改善效果显著优于单一因素干预，此研究为抗阻运动联合药物，为IR患者改善体脂代谢提供了新的思路和实验依据。

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