过量表达棉花GDSL脂肪酶提高甘蓝型油菜油脂含量的研究
2014-12-27郝晓云蔡永智袁哈利李鸿彬
郝晓云 蔡永智 袁哈利 李 榕 王 斐 李鸿彬,2
(石河子大学生命科学学院1,石河子 832003)(石河子大学农业生物技术重点实验室2，石河子 832003)
过量表达棉花GDSL脂肪酶提高甘蓝型油菜油脂含量的研究
郝晓云1蔡永智1袁哈利1李 榕1王 斐1李鸿彬1,2
(石河子大学生命科学学院1,石河子 832003)(石河子大学农业生物技术重点实验室2，石河子 832003)
GDSL脂肪酶作为一种脂质水解酶具有广泛的底物特异性，在植物的油脂代谢、生长发育等众多生理过程中发挥着重要作用。利用RT-PCR技术从发育的陆地棉种子中克隆得到棉花的GDSL脂肪酶基因的cDNA，该基因开放读码框为1 068 bp，编码含有356个氨基酸的蛋白质。对棉花种子发育不同时期进行半定量PCR分析的结果表明，在种子发育15～20 d时，GhGLIP基因的表达量较高。将该基因构建到真核表达载体pCAMBIA2300中，转入农杆菌GV3101后转化甘蓝型油菜野油19，通过筛选和鉴定获得转基因阳性油菜株系。转基因油菜的GDSL脂肪酶活力获得了显著提高，转基因油菜种子的油脂含量比野生型油菜提高了8.68%，提高比率为24.3%。
棉花种子 GDSL脂肪酶 油脂含量 甘蓝型油菜
油菜是我国重要的油料作物，油菜籽不仅可以用于榨油供人们食用，还可以作为生物柴油的原料，对其含油量的研究一直是研究的热点。油菜籽含油量的高低因品种类型不同而有很大差异。与加拿大等国相比，我国多数油菜品种的含油量偏低，尤其是长江流域冬油菜产区的菜籽含油量仅为40%左右，比加拿大的油菜品种低2%～3%，油脂加工效益较低[1-2]。因此，国内外许多学者在育种、栽培、基因工程技术等领域开展了大量研究，以期达到提高油菜种子含油量的目的[3]。在与种子含油量密切相关的生理生化方面，如蛋白质、可溶性糖、淀粉等与种子含油量相关的报道较多。刘后利[2]认为油菜种子成熟期即脱水期油脂含量与脂肪酶的参与有很大的关联。
GDSL脂肪酶(GDSL lipase,GLIP)是一种脂质水解酶，许多研究表明GDSL脂肪酶在植物的油脂代谢及生长发育过程中发挥着重要作用。Eastmond[4]从拟南芥中获得一个脂肪酶基因SDP1，该基因的缺失会导致拟南芥种子萌发受阻，在培养基中添加蔗糖后植物能够继续萌发生长。该基因编码的蛋白定位于油体表面，主要在种子发育过程中表达。Ling等[5]从甘蓝型油菜中克隆了2个GDSL脂肪酶基因BnLIP1 和BnLIP2，发现它们很可能与油菜种子的萌发、花和角果的形成及发育有关。Padham等[6]克隆了质体相关的脂肪酶基因At2g31690，认为该基因可能通过油体内的三酰甘油来维持叶绿体的完整性。植物脂肪酶不只在种子中表达，在拟南芥的根、茎、叶、花中都有表达，尤其在衰老的叶片中有高量表达[7]。
目前，对棉花GDSL脂肪酶的克隆和功能研究鲜有报道。在前期建立的甘蓝型油菜野油19的再生体系基础上[8]，本研究从陆地棉徐-142发育的种子中克隆得到一个棉花GDSL脂肪酶基因GhGLIP，将该基因转入甘蓝型油菜野油19，显著提高了油菜种子油脂含量。本研究为阐明棉花GDSL脂肪酶基因在棉花种子发育过程中及在油菜种子含油量调控中的重要作用提供了参考，并为进一步培育高含油量油菜品种提供了基础。
1 材料与仪器
1.1 植物材料
陆地棉徐-142、甘蓝型型油菜野油19由本实验室培养，种子材料经液氮速冻后，于-80 ℃冰箱保存。
1.2 菌株和表达载体
大肠杆菌DH 5α、农杆菌GV 3101和表达载体pCAMBIA 2300由本实验室保存。
1.3 试剂和酶
琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、2×PCR Master Mix：天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ、XbaⅠ、T4 DNA Ligase、RNA反转录试剂、pMD-19T Vector：大连宝生物公司；对硝基苯酚棕榈酸酯：上海铭睿生物科技有限公司；其他试剂为国产分析纯。
1.4 仪器
Eppendorf PCR仪、Eppendorf 5424R型离心机：Eppendorf North America；HVE-50型高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；Tannon Epson100型核酸电泳仪：上海天能设备有限公司；微波炉：佛山市顺德区美的微波炉电器制造有限公司；BHC-1300A/B3型超净工作台：苏州市苏信净化设备厂；ZF-158型凝胶成像分析系统：上海金鹏分析仪器有限公司；ZF-90型多功能暗箱式紫外透射仪：郑州南北仪器设备有限公司(南北设备集团)；ZSD-A1270A恒温培养箱、ZHWY-100B恒温摇床：上海智诚分析仪器有限公司；JY200C型蛋白质电泳仪：北京君意华鑫科技有限公司。
2 试验方法
2.1 基因克隆
2.1.1 RNA的提取
RNA所用的EP管、枪头盒、枪头、试剂瓶等经DEPC水处理24 h，高压灭菌处理后使用，研钵和药勺经180 ℃烘烤6 h后备用[9]。参考李晶等[10]的方法提取棉花种子总RNA。
2.1.2 RNA反转录合成cDNA
用反转录试剂以提取的RNA为模板反转录成cDNA。反转录过程如下：在200 μL EP管中加入以下试剂：Total RNA 7 μL，Oligo(dT)2 μL，DEPC处理水1 μL；70 ℃水浴5 min；冰浴5 min；在上述EP管中再加入以下试剂：5×AMV RT synthesis buffer 4 μL；AMV Reverse Transcriptase(200 U/μL)1 μL；10 mmol/L dNTP Mixture 2 μL；RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL；EDPC 处理水2 μL；37 ℃水浴60 min；70 ℃水浴10 min；冰浴5 min后，于-20 ℃保存备用。
2.1.3 GhGLIP基因全长开放读码框的获得
根据从GenBank EST数据库所获得的棉花片段序列信息，利用软件设计上下游引物，并添加酶切位点和保护碱基，划线部分为酶切位点，前面是保护碱基，上下游酶切位点分别为KpnⅠ和XbaⅠ，引物序列如下：
GhGLIP上游：5′-CGGGGTACC ATGGATGGTTATTGTAGCAGAAGG-3′
GhGLIP下游：5′-TGCTCTAGA AATGAGGGC AATGCCCTGAA-3′
PCR反应体系(20 μL)：2×PCR Master Mix 10 μL；模板DNA 2 μL；上、下游特异性引物(25 μM)各0.2 μL； ddH2O 7.6 μL。将反应物加入0.2 mL EP管中，瞬时离心混匀，进行PCR反应。
反应程序：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 15 s，30次循环，72 ℃延伸7 min。
PCR反应结束后，用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。
2.2 半定量RT-PCR分析
以棉花开花后0、5、10、15、20、30、40、50、60 d的种子和发育15～20 d的棉花幼苗为材料，提取总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，对GhGLIP基因的表达量进行分析。选择UBQ7为内参基因，引物序列为：
上游：5′-AGAGGTCGAGTCTTCGGACA-3′
下游：5′-GCTTGATCTTGGGCTTG-3′
PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，28个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，PCR产物为200 bp。
以调节好浓度的cDNA为模板，用GhGLIP基因的RT-PCR引物，进行PCR反应，对基因表达量进行检测，PCR产物为425 bp。GhGLIPRT-PCR引物序列如下：
上游引物：5′-CCTTGGCCCAGAAGCATCAG-3′
下游引物：5′-TCTCGTGGTAACCGAACAAT-3′
RT-PCR反应条件：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，25次循环，72 ℃延伸10 min。
2.3 GLIP蛋白酶活力分析
取约0.1 g材料，加入预冷的2 mL 50 mmol/L 的磷酸缓冲液(pH 7.0)，研磨成匀浆，转入2 mL 离心管中，4 ℃，13 000 r/min离心15 min,收集的上清液为蛋白酶提取液，用于后续的酶活力测定。酶活力测定反应混合物含有50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0),1 mmol/L对硝基苯酚月桂酸酯，5%异丙醇，加入含50 μg蛋白酶提取液，37 ℃反应15 min， 100 ℃放置1～2 min，冷却至室温后在405 nm处的紫外分光光度计下测定吸光度值。以每分钟对硝基苯酚月桂酸酯生成1 mmol/L对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
2.4 植物表达载体的构建
植物表达载体为pCAMBIA2300，酶切位点设计、PCR、电泳等其余步骤同2.1.3。
2.5 油菜的遗传转化
2.5.1 转化受体的获得
油菜无菌苗的获得和外植体的选择参考文献[8]方法。将培养5 d的无菌油菜苗的下胚轴切成0.5～1 cm的小段，MS+1.5 mg/L 2,4-D预培养4 d，准备进行农杆菌介导的遗传转化。
2.5.2 农杆菌介导法转化油菜
将pCAMBIA2300-GhGLIP质粒转入农杆菌GV3101后并转化野油19[8,12]，获得的再生芽长到2～3 cm时，剪下并移栽到生根培养基中(1/2 MS+0.5 mg/L IBA+15 mg/L Kan+400 mg/L Cef)。15～20 d待根系发育好后，打开培养基瓶口，炼苗2 d，洗去无菌苗上的培养基，移栽到草炭土∶珍珠岩=3∶1的土中[13]，在培养室培养。
2.6 转基因油菜的筛选与鉴定
收取T0转基因油菜种子后，将其种在MS+100 mg/L Kan培养基中进行筛选和培养10 d。将含有抗性的苗移至草炭土∶珍珠岩=3∶1的土壤中进行培养，当油菜苗长出真叶后，对含有抗性的油菜苗，提取总DNA，进行PCR鉴定。PCR鉴定出来的苗为转基因油菜。
2.7 油菜油脂含量的测定
用酸水解法测定总脂含量[14-15]。称取成熟的且已烘干的油菜种子约0.25 g，将种子在研钵中研碎，置于10 mL带盖离心管中，加入1 mL灭菌蒸馏水， 混匀后加入1.5 mL 盐酸,将离心管置于75 ℃水浴中20 min，取出离心管，加入1.5 mL 95%的乙醇，混匀。冷却后加入2.5 mL 乙醚，加盖振摇1 min，小心开盖，不断放出管内的气体。4 000 r/min离心2 min，吸取上清液于已恒重的锥形瓶中，再加1 mL乙醚于离心管中，加盖振摇1 min，4 000 r/min离心2 min，吸取上清液于原锥形瓶中。将锥形瓶置于水浴锅上蒸干，再置于95 ℃ 烘箱中干燥2 h，取出冷却后称重。
式中：m0为称量的油菜种子的质量/g；m1为锥形瓶的质量/g；m2为锥形瓶和脂肪的总质量/g。
3 结果与讨论
3.1 GhGLIP基因的克隆
用CTAB法提取棉花胚珠的总RNA，结果显示RNA呈现成明显的2条带，提取的RNA质量较好，可进行反转录合成cDNA进行后续试验(图1a )。以cDNA为模板，通过PCR扩增获得目的片段，连接T载体后，测序获得GhGLIP基因的全长序列，片段大小为1 068 bp，与预期的结果相符(图1 b)。
注：1、2为RNA的电泳检测结果，M为DNA MakerⅢ; 3、4为PCR扩增条带。
图1GhGLIP基因克隆
3.2 GhGLIP蛋白的序列比对与进化树构建
将获得的GhGLIP氨基酸序列与大豆GmGLIP、苜蓿 MtGLIP、油菜 BnGLIP1、油菜BnGLIP2等植物的氨基酸序列进行对比。结果显示这几种植物的氨基酸序列在N-端含有信号肽，都具有典型的保守域blockⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ。GDSL-motif位于blockⅠ中，Ser作为blockⅠ的亲核体，把质子供体传给氧离子孔；blockⅡ中的Gly和blockⅢ中的Asn为氧离子孔提供两个其它的质子供体；blockⅤ中的His残基能使blockⅠ中的Ser通过去质子化而更加亲核(图2)。将棉花的GhGLIP氨基酸序列与其他几种植物GLIP的氨基酸序列构建系统进化树，棉花 GhGLIP和高粱及油菜的进化关系较近(图3)。
注：横线表示信号肽; ▼表示活性位点; ●表示氧离子孔的位置; 方框表示保守域。植物GLIP的Genbank 登录号为:GmGLIP:NM_001255437.2; MtGLIP:XP_003629880.1; BnGLIP1:AAX59709.1; BnGLIP2:AAX58135.1。
图2 棉花GhGLIP的氨基酸序列比对
注：植物GLIP的Genbank 登录号为：GmGLIP:NM_001255437.2; MtGLIP:XP_003629880.1; CaGLIP1:DQ119290.1; AtGLIP:NP_174259; MbGLIP:ABF70089.1; BdGLIP:XP_003569805.1; PtGLIP:XP_002304022.1; SbGLIP:ADQ08655.1; BnGLIP2:AAX58135.1; BnGLIP1:AAX59709.1; ZmGLIP:AFW63334.1; VvGLIP:CAN82331.1; OsGLIP:BAD73018.1。
图3 棉花GhGLIP的进化树构建
3.3 GhGLIP基因在棉花种子不同发育时期的表达分析
对棉花0～60 d不同发育时期的胚珠和棉花幼苗进行表达分析。在棉花开花后10～20 d的胚珠中GhGLIP基因的表达量较高，在15 d表达量达到最高，30 d后几乎检测不到表达量。GhGLIP基因在棉花幼苗的茎和叶中有一定表达，在根中几乎检测不到(图4)。
图4 棉花GhGLIP基因的表达分析
3.4 植物过量表达载体的构建与转基因油菜的筛选鉴定
按照图5所示构建植物过量表达载体。对测序正确的质粒和pCAMBIA2300质粒同时用KpnⅠ和XbaⅠ进行双酶切，回收目的片段和载体大片段，连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定(图6a)，并进一步对质粒进行双酶切鉴定(图6b)，成功构建了植物过量表达载体pCAMBIA2300-GhGLIP。
图5 pCAMBIA2300-GhGLIP表达载体构建示意图
注：图a中M,MakerⅢ; 1-7,菌液PCR产物; 8,阳性对照; 9,阴性对照; M,MakerⅢ;图b中1,双酶切产物。
图6 植物过量表达载体的鉴定
以油菜幼苗的下胚轴为受体，利用农杆菌介导法转化油菜。将转化成功的幼苗移入土壤中进行培养，直至成熟。收获种子后，通过抗生素卡那霉素初筛获得含有Kan抗性的油菜植株。对含有抗性的油菜植株进一步提取DNA进行PCR鉴定(图7)，获得转基因油菜株系。
注：M,Marker Ⅲ; 1～10为不同转基因株系的GhGLIP基因的PCR条带; 11为阳性对照; 12为阴性对照。
图7 转基因油菜的鉴定
3.5 油菜酶活力和油脂含量分析
对获得的转GhGLIP基因油菜测定其GDSL脂肪酶活力，野生型油菜的酶活力为 18.6，转基因油菜的酶活力为 88.3，转基因油菜的GDSL酶活力获得了显著的提高；用酸水解法测定野生型油菜和转基因油菜种子的油脂含量，野生型油菜的油脂质量分数为35.67%，转基因油菜的油脂质量分数为44.35%，转GhGLIP基因的油菜种子油脂含量提高了8.68%，提高比率为24.3 %(图8)。
注：WT为野生型油菜;GhGLIP为转基因油菜。**表示P<0.01,***表示P<0.001。
图8 油菜酶活力和油脂含量分析
4 讨论与结论
GDSL脂肪酶通过水解脂质进一步参与植物油脂代谢和生长发育等生理过程。目前，许多GDSL脂肪酶基因已经获得了克隆，具有表达的组织特异性并参与种子萌发、油体形成等过程[5-7]，本研究从棉花胚珠中克隆得到一个GDSL脂肪酶基因GhGLIP，这也是首次对棉花该基因的研究，GhGLIP具有典型的GDSL结构域和保守的功能域。GhGLIP基因表达具有一定的特异性，在10～20 d发育的胚珠中表达量较高，在茎和叶中也有部分表达。
油菜的遗传转化是近年来的一个研究热点，农杆菌介导的转化法是常用的转化方法，但是农杆菌介导的转化法转化效率较低，并且受很多因素如外植体再生体系、基因型差异等的影响。在甘蓝型油菜转化体系中，研究者已经用下胚轴、花序茎、小孢子、茎节间以及子叶等进行转化得到了一些转化体，但转化率均不太高，其中在外植体选择上用下胚轴和子叶的较多[12-13,16-18]。本研究以甘蓝型油菜野油19号的下胚轴为外植体，转化率约为7.4%，建立了野油19的再生体系。构建了植物过量表达载体并转化油菜，通过筛选和鉴定，获得了转GhGLIP基因油菜株系。
脂肪酸合成是种子胚胎发育过程中油脂积累的关键因素。研究表明很多基因都能调控种子的含油量，如拟南芥ACC合成酶、酵母中与三酰甘油酯合成相关的溶血磷脂酰基转移酶、拟南芥二酰甘油酰基转移酶等，这些基因的过量表达使种子含油量提高了5%～25%[19-22]，本研究将棉花GDSL脂肪酶基因GhGLIP转化甘蓝型油菜，转基因油菜GDSL酶活力表达获得了显著的提高，种子含油量提高了8.68%，提高率约为24.3%，说明GDSL脂肪酶活力的提高与种子油脂含量之间的密切联系。
脂肪酸是生物体中重要的组成成分，参与细胞发育过程中一些重要的信号转导过程，因此，细胞中脂肪酸的组成、含量及存在形式对细胞的生存和正常生长是至关重要的。GDSL脂肪酶能水解多种酯类物质而产生不同形式的脂肪酸，可能通过调节脂肪酸的合成，以及参与激素乙烯介导的信号途径而进一步调控植物种子的油脂含量[23-24]。
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Overexpression of a Cotton GDSL Lipase Increases the Oil Content ofBrassicanapusL.
Hao Xiaoyun1Cai Yongzhi1Yuan Hali1Li Rong1Wang Fei1Li Hongbin1,2
(College of Life Science of Shihezi Universtiy1, Shihezi 832003)(Key Laboratory of Agrobiotechnology of Shihezi University2, Shihezi 832003)
GDSL lipase (GLIP), a lipid hydrolase with broad substrate specificity, exists in plant tissues, playing important roles in plants' lipid metabolism, growth and development and many other physiological processes. In the study, a cotton GDSL lipase named GhGLIP has been isolated from cotton ovules by RT-PCR method. The full open reading frame was 1 068 bp, containing a protein of 356 amino acids. Semi-quantitative PCR analysis of different cotton ovule development periods showed thatGhGLIPgene expressed higher values in 15～20 d ovules. The plant over expression vector pCAMBIA2300-GhGLIP was obtained then transformed intoBrassicanapusL. (wild-
oil 19) by agrobacterium mediated method. Transgenic oilseed rape plants were obtained after screening and identification with a significant promotion of GDSL lipase enzyme activity; the oil content of transgenic Brassica napus seeds was significantly enhanced by 8.68% higher and a increase ratio of 24.3% than wide-type.
cotton seed, GDSL lipase, oil content, L.
TS213.2
A
1003-0174(2014)06-0063-07
国家自然科学基金(31260339)，兵团种质资源创新专项(2012BB050)，石河子大学杰出青年项目(2012ZR KXJQ03)
2013-06-20
