共表达蛋白质折叠辅助因子对毕赤酵母分泌表达IFNβ-HSA融合蛋白质的影响

陈凤祥， 关 波， 陈 蕴， 段作营， 金 坚， 李华钟*

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

干扰素 β（Interferon β，IFNβ）是由人成纤维细胞分泌的一种糖蛋白质，它是一种具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖、免疫调节等多种生物活性的细胞因子，由166个氨基酸残基组成，相对分子质量为22 000～23 000[1-2]。由于IFNβ相对分子质量较小，易被肾小球滤过，因而在体内的半衰期较短。作者所在实验室前期利用基因融合技术将IFNβ与人血清白蛋白质（Human serum albumin，HSA）基因融合，并成功地在毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71中进行了表达，融合蛋白质具有HSA和IFNβ的抗原性以及良好的临床应用前景[3]。

研究表明，外源蛋白质过量表达时，初生肽链在内质网中折叠、加工和转运途径超载，造成蛋白质错误折叠，成为外源蛋白质分泌表达的限速步骤[4]。分子伴侣BiP是定位于内质网腔内的伴侣蛋白质，能帮助新合成蛋白质完成进一步的折叠，或者与未折叠蛋白质、错误折叠蛋白质结合并通过内质网相关的降解（ER associated degradation，ERAD）途径实现其降解[5-6]。有文献报道，共表达分子伴侣BiP能够促进毕赤酵母分泌外源蛋白质[7]；但也有研究表明，BiP的过量共表达会对外源蛋白质表达造成负面影响[8]。分析其原因可能是过表达BiP将导致其辅助分子伴侣Lhs1p或内质网腔内ATP等含量不足，过多的BiP不再能发挥分子伴侣活性，从而使蛋白质进入ERAD途径而被降解[9-10]。

二硫键异构酶（PDI）能够加速对蛋白质的进一步折叠，主要负责二硫键的形成和异构化，能够防止新生多肽多聚体产生，而且能使错误折叠的蛋白质重新正确装配[11]。二硫键的形成需要氧化型PDI再生，而黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的内质网氧化还原酶（Endoplasmic reticulum oxidation 1，Ero1）能促进氧化型PDI再生，从而激活其活性[12-13]。

研究中使用相对温和的GAP启动子，构建了共表达Ero1、PDI和BiP等蛋白质折叠辅助因子的Pichia pastoris GS115/pPIC-IFNβ-HSA菌株，考察共表达这3种蛋白质折叠辅助因子对融合蛋白质表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

融合蛋白质表达菌株Pichia pastoris GS115/pPIC-IFNβ-HSA和蛋白质折叠辅助因子表达载体pGAP-Ero1、pGAP-PDI、pGAP-BiP 由作者所在实验室构建并保藏，酵母表达载体pGAPZ B购自Invitrogen公司。

1.2 主要试剂

限制性内切酶AvrII，购自Thermo公司；PCR产物纯化试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母基因组提取试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司；酸洗玻璃珠 （500 μm），购自Sigma公司；博来霉素（Zeocin），购自美国Invitrogen公司；酵母浸粉（Yeast Extract）、胰蛋白胨（Tryptone Powder），购自OXOID公司；其它试剂均为进口或国产分析纯。

1.3 共表达转化子的构建与验证

将 pGAP-Ero1、pGAP-PDI和 pGAP-BiP 共表达质粒和pGAPZ B空载分别用AvrII限制性内切酶进行线性化，电击转化GS115-IFNβ-HSA感受态细胞（1.5 kV、5 ms）[14]。 加入预冷的 1 mol/L 山梨醇30℃静置培养1 h后，再加入YPD培养基30℃振荡培养 2 h， 涂布 YPD平板 （含 400 μg/mL的Zeocin），置于30℃培养箱中培养3 d。

挑取若干YPD平板单菌落分别接种于5 mL YPD 液体培养基中 （含 100 μg/mL Zeocin），200 r/min、30℃培养24 h，用酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用pGAP载体通用引物（正向：5′-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3′；反向：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）进行 PCR扩增。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以验证各蛋白质折叠辅助因子基因的过表达载体是否成功整合至重组酵母菌中。

1.4 Ero1、PDI、BiP 的 Western blot分析

共表达菌株胞内蛋白质提取及诱导表达参照pGAPZ B说明书进行。提取经基因组DNA PCR验证正确的共表达菌株的胞内蛋白质进行Western blot分析。

由于在构建共表达质粒时，将Ero1、PDI和BiP终止密码子去除，使得6×His标签分别与Ero1、PDI和BiP的C端融合表达（图1）。因此，可利用抗6×His抗体检测各蛋白质折叠辅助因子是否在重组酵母胞内过量表达。

图1 pGAP-Ero1、pGAP-PDI和pGAP-BiP质粒图谱Fig.1 Schematic map of pGAP-Ero1，pGAP-PDI and pGAP-BiP plasmids

1.5 共表达 Ero1、PDI和 BiP菌株分泌表达IFNβ-HSA的SDS-PAGE和Western blot分析

接种共表达 Ero1、PDI和 BiP的重组菌株至BMGY培养基培养，收获菌体后在BMMY培养基中用体积分数2%甲醇诱导表达，将不同诱导时间的发酵液离心后取上清液，进行SDS-PAGE和Western blot分析，并用图像处理软件ImageJ对SDS-PAGE结果进行灰度定量，用统计分析软件SPSS对定量结果进行统计分析。

1.6 共表达重组菌株生长测定

将各共表达菌株和转化pGAPZ B空载的对照菌株分别接种至YPD液体培养基，200 r/min、30℃振荡培养24 h，以体积分数1%接种量接种至BMGY培养基，200 r/min、30℃培养，采用比浊法（OD600）测定菌体生长。

2 结果与分析

2.1 共表达Ero1、PDI和BiP酵母菌株的构建及其阳性转化子的筛选

将线性化的 pGAP-Ero1、pGAP-PDI、pGAP-BiP和空载pGAPZ B电击转化GS115-IFNβ-HSA感受态细胞。分别从YPD（含400 μg/mL Zeocin）平板上挑取转化子若干，以其基因组DNA为模板，进行PCR扩增，结果如图2所示。

图2 酵母基因组DNA的PCR鉴定Fig.2 Identification of genome of Pichia pastoris

结果显示，转化空载的菌株基因组DNA经扩增后获得约250 bp的片段 （C泳道）；而以转化pGAP-Ero1、pGAP-PDI和pGAP-BiP菌株的基因组DNA为模板时，PCR扩增产物在约2 000 bp处各有明显条带，表明 pGAP-Ero1、pGAP-PDI和pGAP-BiP表达框已成功整合至相应转化子基因组。

2.2 Ero1、PDI和BiP表达的Western blot分析

为了验证蛋白质折叠辅助因子 Ero1、PDI和BiP在胞内过量表达，用抗6×His抗体对Ero1、PDI和BiP共表达菌株和对照菌株胞内蛋白质进行了Western blot分析，结果如图3所示。

对照菌株胞内蛋白质的Western blot杂交没有出现特异性条带，而Ero1、PDI和BiP共表达菌株胞内蛋白质Western blot均出现特异性杂交条带，表明蛋白质折叠因子Ero1、PDI和BiP分别在共表达菌株中被过量表达。Ero1、PDI和BiP蛋白质杂交条带均比理论分子量略大，Ero1尤其显著，这可能是由于毕赤酵母的Ero1自身存在糖基化修饰造成的[15]。

图3 蛋白质折叠辅助因子Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of folding helper factors

2.3 Ero1、PDI、BiP共表达对重组菌株生长的影响

为了分析共表达各种蛋白质折叠辅助因子是否对重组毕赤酵母菌株的生长有不利影响，对共表达Ero1、PDI、BiP的菌株和对照菌株在BMGY培养基中的生长进行了测定，结果如图4所示。

图4 pGAPZ B、Ero1、PDI及BiP菌株的生长曲线Fig.4 Growth curves of strains co-overexpressing pGAPZ B Ero1，PDI and BiP

结果表明，各种共表达菌株的生长曲线与对照菌株均无明显差异。各菌株培养约24 h后到达平衡期，此时酵母细胞密度OD600≈50。这说明，共表达Ero1、PDI、BiP 对 IFNβ-HSA 融合蛋白质表达菌株的正常生长没有影响。

2.4 Ero1、PDI和 BiP共表达对融合蛋白质IFNβ-HSA分泌表达的影响

为了分析共表达Ero1、PDI、BiP是否对融合蛋白质IFNβ-HSA的分泌表达有促进作用，将共表达Ero1、PDI、BiP的菌株和对照菌株分别诱导表达72 h后，离心取上清液，对各个菌株的IFNβ-HSA表达作SDS-PAGE和Western blot分析，并用ImageJ软件对其表达量作相对定量，结果见图5。

图5 表达产物IFNβ-HSA的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.5 Analysis of the expression of product IFNβ-HSA

由图5可知，对照菌株和共表达菌株均表达融合蛋白质IFNβ-HSA（分子量约90 kD）。利用SPSS对ImageJ定量结果进行统计分析，结果如表1所示，诱导72 h后，Ero1、PDI和BiP共表达菌株融合蛋白质表达量分别是对照菌株的1.8倍、1.9倍和1.1倍，且具有统计学意义（P≤0.05），表明共表达Ero1和PDI对提高重组毕赤酵母外源蛋白质的表达量具有显著作用，而共表达BiP对重组毕赤酵母外源蛋白质的表达水平没有影响。

表1 蛋白质辅助折叠因子表达量的统计Table 1 Mean improvements of IFNβ-HSA by coexpression of folding helper factors

见上图5，共表达PDI时，SDS-PAGE结果显示，表达产物中还存在一分子量约为50 kDa的条带，用抗 HSA 抗体作 Western blot分析（图 5（b））可见，杂交结果显示此条带并非表达产物IFNβ-HSA的相关条带，其具体来源有待进一步研究。

3 结语

本实验中，通过在GS115-IFNβ-HSA中分别共表达Ero1、PDI和BiP，探索了过量表达内质网中这3种蛋白质折叠辅助因子对外源蛋白质IFNβ-HSA分泌表达的影响。实验结果表明，Ero1、PDI和BiP成功地在胞内过量表达，且不影响宿主细胞的正常生长。共表达Ero1和PDI的重组菌株，其IFNβ-HSA融合蛋白质表达量有不同程度的提高，分别是对照菌株的1.8倍和1.9倍。这表明二硫键的形成过程可能是外源蛋白质IFNβ-HSA分泌表达过程中的限速步骤之一，通过在Pichia pastoris GS115细胞中分别共表达Ero1和PDI，可能促进了融合蛋白质IFNβ-HSA折叠过程中二硫键的形成，有助于融合蛋白质在内质网中的折叠加工，从而提高了外源蛋白质IFNβ-HSA的表达量。共表达BiP的重组菌株中，IFNβ-HSA融合蛋白质的表达量与对照组相当，可能过表达BiP加重重组菌株表达外源蛋白质的负担，使得过多的BiP已不能发挥蛋白质辅助因子的活性。已有的文献报道显示，共表达BiP对外源蛋白质表达的影响存在较大差异[16]，在某些情况下，共表达BiP对一些外源蛋白质表达没有显著影响[17]。因此，组合表达不同的蛋白质折叠辅助因子能否进一步提高目的蛋白质的产量，值得深入研究。

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