温敏型透明质酸纳米靶向药物传递系统

陈荆晓， 曹璐娟， 孟照敏， 刘伯政， 陈敬华

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

纳米药物传递系统因其特有的增强渗透滞留效应（EPR effect），可提高药物在肿瘤区域的蓄积，因而受到生物医学领域科研人员的广泛研究[1-2]。为提高纳米药物载体在体内的可降解性，降低肝、肾代谢的远期毒性，同时能够进一步增强材料的生物活性，蛋白质、多肽、多糖等生物大分子被用于替代传统的合成型高分子材料[3-4]。利用这些天然大分子的生物学特性，可显著改善纳米粒子在体内的分布，提高药物传递的靶向性。在这之中，透明质酸（Hyaluronic acid，HA）因可特异性识别肿瘤细胞表面过度表达的CD44受体，因而被广泛用于构建纳米靶向药物传递系统[5]。

尽管透明质酸可提高药物传递的靶向作用，但由于人体内存在透明质酸酶，导致材料在体内易受酶作用而降解[6]。这既会降低材料在血液中的循环时间，也有可能造成药物的泄露而降低药物传递的效率。有研究发现，通过连接聚乙二醇可有效抑制蛋白质吸附，防止酶对透明质酸的降解作用，提高其在体内的稳定性[7]。这主要是由于聚乙二醇可以有效抑制血浆蛋白质、酶等物质在材料表面的粘附。另外，聚乙二醇还具有一定的温敏性能，这也为药物载体的开发提供了新的策略[8]。

本研究中拟通过“Click”反应连接透明质酸和普朗尼克F127，构建两亲性材料HA-F127，其化学结构如图1所示。

图1 HA-F127的化学结构Fig.1 Chemical structure of HA-F127

利用透明质酸的亲水性稳定纳米粒子，同时利用其与CD44受体的识别作用，提高对肿瘤细胞的靶向作用。另外，利用F127与聚乙二醇类似的生物惰性，提高透明质酸纳米粒子的稳定性。由于F127为两亲性物质，由其提供的疏水作用力可以用于包载疏水性抗肿瘤药物，其温敏特性还能赋予材料智能“开/关”的药物释放行为。期望这一纳米粒子可有效实现抗肿瘤药物的靶向传递，降低药物的毒副作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

透明质酸，普朗尼克F127，炔丙胺，抗坏血酸钠，购于生工生物工程（上海）股份有限公司；叠氮化钠，购于上海晶纯生化科技股份有限公司；盐酸阿霉素，购于浙江海正药业公司；对甲苯磺酰氯，乙基[3-（二甲胺基）丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），购自国药集团化学试剂有限公司；DMEM细胞培养基，噻唑蓝（MTT），胎牛血清（FBS），双抗（penicillin-streptomycin），磷酸盐缓冲液干粉（PBS），分别从Gibco和Invitrogen公司购得；分子探针DAPI，购于Sigma-Aldrich公司；其他溶剂及试剂购于国药集团化学试剂公司，使用前纯化。人类宫颈癌细胞（HeLa）和非洲绿猴肾成纤维细胞（COS7），购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 主要仪器

FreeZone 2.5型冷冻干燥机，美国Labconco公司制造；JEM-2100型透射电子显微镜，日本JEOL公司制造；Avance III型核磁共振波谱仪，德国Bruker公司制造；Nano ZS型粒径测试仪，英国Malvern公司制造；RF-5301PC型荧光分光光度计，UV-2550型紫外可见分光光度计，日本岛津公司制造；DMIL LED型倒置荧光显微镜，德国徕卡公司制造。

1.3 实验方法

1.3.1 单叠氮化普朗尼克 （F127-N3）的制备 将12.5 g的 F127（1 mmol）溶于 50 mL 二氯甲烷中，加入25 mL吡啶，之后在冰浴下缓慢加入285 mg（1.5 mmol）对甲苯磺酰氯，避光并在N2保护，25℃条件下反应24 h。反应结束后用浓盐酸萃洗，有机层用质量分数5%NaHCO3洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，无水乙醚中沉淀得F127-对甲苯磺酸酯。之后将其用新蒸的DMF溶解，加入650 mg（10 mmol）叠氮化钠于60℃搅拌反应，48 h后于截留分子量10 kDa的透析袋去离子水中透析2 d，冷冻干燥得产物F127-N3，产品经凝胶渗透色谱进行检测并提纯。

1.3.2 炔基化透明质酸 （HA-alkynyl）的制备 将190 mg（0.5 mmol双糖单元）透明质酸溶于100 mL去离子水中，加入 192 mg（1 mmol）EDC 及 115 mg（1 mmol）NHS。 活化 30 min 后，加入 68 μL（1 mmol）炔丙胺后继续于室温下反应24 h。结束后于截留分子量10 kDa透析袋去离子水中透析2 d，冷冻干燥得产物HA-alkynyl。

1.3.3 F127功能化透明质酸 （HA-F127）的制备将 600 mg（0.05 mmol）F127-N3及 90 mg（0.2 mmol）HA-alkynyl溶于去离子水中，搅拌溶解后加入7.6 mg（0.03 mmol）CuSO4·5H2O 及 50 mg（0.25 mmol）抗坏血酸钠，于40℃，N2保护下反应48 h。反应结束后于截留分子量25 kDa的透析袋去离子水中透析2 d，冷冻干燥得产物HA-F127，产物经1H NMR确认结构。

1.3.4 HA-F127纳米粒子的制备及形貌表征 根据文献报道方法[9]，通过荧光探针法测定室温15℃下HA-F127的临界聚集质量浓度为0.07 mg/mL。HA-F127纳米粒子的制备为直接将其溶解于水溶液中，质量浓度为0.1 mg/mL。通过粒径仪测定纳米粒子的大小，并通过透射电子显微镜观测纳米粒子的形貌。

1.3.5 载药纳米粒子的制备 载药纳米粒子通过透析法制备[10]。将2 mg盐酸阿霉素溶于2 mL DMF中，加入3当量于盐酸阿霉素的三乙胺于避光条件下搅拌过夜，之后加入3 mL溶有10 mg HA-F127的甲酰胺溶液，搅拌均匀后加入到3 500 Da透析袋中，于室温下对去离子水透析12 h，得到载药纳米粒子，将溶液冻干，用紫外可见分光光度计于480 nm处测定阿霉素的载药量及包封率。

1.3.6 体外药物释放实验 取上述透析得到的载药纳米粒子溶液2 mL，装入3 500 Da透析袋中，然后浸入装有10 mL PBS（pH 7.4）的离心管中，分别于15℃及37℃条件下进行体外药物释放实验，每隔一段时间取出PBS溶液，并补充10 mL新鲜的PBS至离心管。用紫外可见分光光度计于497 nm测定阿霉素的释放情况，每组3个平行样。

1.3.7 体外细胞毒性测试 HA-F127及载药纳米粒子的细胞毒性分别采用HeLa和COS7两种细胞通过MTT法进行测定。将生长至对数期的两种细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板，之后将HAF127和载药纳米粒子分别溶于含有体积分数10%胎牛血清的培养基中，配制成设定浓度梯度的溶液，然后加入到细胞培养板中，培养48 h后吸除溶液，加入DMEM培养基，然后加入20 μL MTT的磷酸盐缓冲溶液（5 mg/mL），用酶标仪测定其在570 nm处的光密度值。阿霉素作为阳性对照对比载药纳米粒子的细胞毒性，溶液中加入体积分数5%DMSO助溶。

1.3.8 纳米粒子的细胞内摄化实验 载药纳米粒子的细胞摄入情况采用HeLa及COS7两种细胞进行测定。首先将对数生长期的HeLa及COS7两种细胞以2×104个/孔的密度接种在24孔板中，培养至贴壁后，弃去孔板中培养基，分别加入灭菌处理后的阿霉素及载药HA-F127纳米粒子，使DOX的终质量浓度为2 μg/mL，之后在37℃湿润环境下培养，1 h后弃去孔内含药培养基，用PBS溶液小心洗涤3次。之后，用质量分数4%多聚甲醛溶液固定细胞 15 min，再用蓝色荧光探针 DAPI（0.2 μg/mL）对细胞核进行染色，15 min后小心移除溶液，并用PBS溶液轻轻润洗数次以除去过量的染料。用倒置荧光显微镜观测并拍照。之后，为验证透明质酸靶向肿瘤细胞的作用，先将HeLa细胞与0.5 mg/mL的透明质酸溶液共培养2 h，之后再加入载药纳米粒子共培养1 h，然后用上述同样方法观测纳米粒子的细胞内摄行为。

2 结果与分析

2.1 HA-F127的合成及结构表征

首先制备单叠氮化F127，之后在透明质酸分子上引入炔基，通过经典的“Click”化学反应连接F127和透明质酸分子，制备得到具有两亲性的材料HAF127，其化学结构见图1。通过1H NMR对产物的结构及F127的接枝率进行表征，结果如图2所示。

图2 HA-F127在D2O中的1H NMR谱图Fig.2 1H NMR spectrum of HA-F127 in D2O

从核磁谱图中可以看出，除透明质酸糖环上氢在2～5 ppm的峰以外，在1.15 ppm处出现了F127上烷基上氢的峰，同时在8.17 ppm处出现了五元氮杂环上氢的峰，这说明F127已通过“Click”反应与HA分子连接起来。通过将8.17 ppm处峰面积积分与2.01 ppm处透明质酸N-乙酰氨基葡萄糖上甲基氢峰面积积分相比较，可以计算出F127的接枝率为0.13，即每百个透明质酸双糖单元上连接有13个F127分子。

2.2 HA-F127纳米粒子的形貌

由于HA-F127分子具有两亲性，因而其在水溶液中具有一定的自组装能力。以芘为荧光探针，测定材料HA-F127的临界聚集质量浓度为0.07 mg/mL，之后在制备HA-F127纳米粒子时，溶液质量浓度均高于此值，采用0.1 mg/mL。HA-F127纳米粒子的形貌通过透射电子显微镜进行观测，结果如图3所示。从图3可以看出，在15℃时，纳米粒子的粒径约为200 nm；而当温度升高至37℃时，纳米粒子的粒径约为60 nm。纳米粒子为形貌规整、大小均一的完整球形结构。这一粒径变化行为主要是由于F127分子链段两端含有亲水的聚乙二醇（PEG）单元，而中间为疏水的聚丙二醇（PPG）单元。当温度升高以后，PEG与水分子之间的氢键被破坏，其转变为疏水性链段。此时，材料的亲疏水比发生变化，由于疏水性增强，材料会向内收缩，形成粒径更小的纳米粒子。

图3 HA-F127纳米粒子在15℃和37℃的透射电镜照片Fig.3 TEM images of HA-F127 nanoparticles at 15℃and 37℃

此后，通过动态光散射测定纳米粒子在水溶液中不同温度下的粒径，结果如表1所示。

表1 HA-F127纳米粒子不同温度下的粒径Table 1 Average size of HA-F127 nanoparticles at different temperature

在15℃时，测得的粒径为275.2 nm，而在37℃时的粒径为80.8 nm，结果大于通过透射电镜观测到的粒径。这主要是由于透射电镜观测的是纳米粒子干态下的粒径，而通过动态光散射测定得到的是粒子的水合粒径，由于亲水层中含有一定的水分子，亲水性分子会向外伸展，因而粒径比电镜测得的结果要更大些。

2.3 体外药物释放

用HA-F127构建纳米粒子并包载疏水性抗肿瘤药物阿霉素，通过紫外检测可知药物的包载量可达到10.6%，药物的包封率为52.9%。载药HA-F127纳米粒子的药物释放行为分别在15℃和37℃条件下测试，结果如图4所示。

图4 HA-F127纳米粒子在不同温度的体外药物释放曲线Fig.4 In vitro drug release profiles ofHA-F127 nanoparticles at different temperatures

从图4可以看出，在两种温度条件下，HAF127纳米粒子均可以表现出对药物阿霉素良好的控制释放行为，而37℃下药物的释放速率和累计释放率均快于15℃下的药物释放行为。这主要是由于HA-F127纳米粒子具有如上所述的温敏性质，在37℃条件下会发生体系的收缩，此时药物的释放速率会明显增快，药物的累积释放率也有所增加。

2.4 HA-F127细胞毒性

材料HA-F127的细胞毒性通过MTT法分别对HeLa肿瘤细胞和COS7正常细胞进行测试，结果如图5所示。

图5 HA-F127对HeLa和COS7细胞的细胞毒性Fig.5 Cytotoxicity of HA-F127 against HeLa and COS7 cells

从图5可以看出，HA-F127对于两种细胞均未表现出明显的细胞毒性，甚至当材料质量浓度达到500 mg/L，两种细胞的存活率仍可维持在90%以上。这一结果说明材料本身不具有明显细胞毒性。这主要是由于HA本身来源于动物体内，具有良好的生物相容性。而F127分子为FDA批准可注射进入人体的药物辅料，其同样具有良好的生物相容性。因而所制备的材料及构建的纳米粒子可用于后续测试。

2.5 载药纳米粒子的细胞毒性

载药纳米粒子对两种细胞的毒性同样通过MTT法进行，同时以等当量的药物阿霉素作为阳性对照，结果如图6所示。从图6（a）中可以看出，对于HeLa肿瘤细胞药物阿霉素的半致死质量浓度（IC50）为0.3 mg/L，载药纳米粒子的IC50值为0.6 mg/L。由于HA-F127纳米粒子本身不具有明显的细胞毒性，这一毒性主要来自于药物阿霉素。载药纳米粒子比药物阿霉素对细胞的IC50略大，这主要是由于一部分药物被包裹在纳米粒子内部，难以完全释放进入细胞核，因而毒性有所降低。而从图6（b）可以看出，药物对于COS7细胞的IC50为3 mg/L，而载药纳米粒子对细胞的IC50则大于8 mg/L。对比HeLa细胞的结果可知，材料能明显提高治疗的选择性。这主要是由于HA可识别HeLa肿瘤细胞表面过度表达的CD44受体，因而可介导更多药物进入HeLa细胞。

图6 载阿霉素HA-F127纳米粒子对HeLa和COS7细胞的细胞毒性Fig.6 Cytotoxicity of DOX-loaded HA-F127 nanoparticles against HeLa and COS7 cells

2.6 细胞内摄化行为

细胞对HA-F127载药纳米粒子的内摄化行为通过倒置荧光显微镜进行观测，照片如图7所示。图7（a）显示，红色荧光的药物阿霉素可进入HeLa细胞并进入经蓝色荧光探针DAPI标记的细胞核，因而表现出对HeLa细胞的显著毒性。图7（b）说明，载药纳米粒子同样可介导阿霉素快速进入HeLa细胞，并且可以观测到有药物进入细胞核。而在经过HA预处理2 h之后，由于HA已经与HeLa细胞表面的CD44受体相结合，此时载药纳米粒子进入细胞的效率降低，从图7（c）可看出，红色荧光明显减弱，这也说明HA-F127纳米粒子进入细胞的途径主要是由配体-受体介导的。而对于图7（d）COS7正常细胞，由于其表面并不含有过度表达的CD44受体，因而HA-F127纳米粒子也难以在短时间内进入细胞。利用这一优势，HA-F127纳米粒子可包载抗肿瘤药物特异性进入肿瘤细胞，提高药物传递的靶向性。

图7 HA-127纳米粒子的细胞内摄化行为Fig.7 Internalization of HA-127 nanoparticles

3 结语

通过“Click”化学反应成功制备了两亲性材料HA-F127，其在水溶液中可自组装形成纳米粒子。由于F127所具有的温敏特性，纳米粒子也可以表现出一定的温敏性。

纳米粒子可以在疏水内核中包载疏水性的抗肿瘤药物阿霉素，同时利用纳米粒子表面透明质酸对肿瘤细胞表面过度表达的CD44受体的识别作用，靶向传递药物进入肿瘤细胞。材料本身具有良好的生物相容性，其有望应用于临床抗肿瘤药物的靶向传递和治疗研究。

[1]Maeda H，Bharate G Y，Daruwalla J.Polymeric drugs for efficient tumor-targeted drug delivery based on EPR-effect[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2009，71（3）：409-419.

[2]Fang J，Nakamura H，Maeda H.The EPR effect：Unique features of tumor blood vessels for drug delivery，factors involved，and limitations and augmentation of the effect[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2011，63（3）：136-151.

[3]Fonseca S B，Pereira M P，Kelley S O.Recent advances in the use of cell-penetrating peptides for medical and biological applications[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2009，61（11）：953-964.

[4]Mizrahy S，Peer D.Polysaccharides as building blocks for nanotherapeutics[J].Chemical Society Reviews，2012，41（7）：2623-2640.

[5]Choi K Y，Chung H，Min K H，et al.Self-assembled hyaluronic acid nanoparticles for active tumor targeting[J].Biomaterials，2010，31（1）：106-114.

[6]Collins M N，Birkinshaw C.Hyaluronic acid based scaffolds for tissue engineering-a review[J].Carbohydrate Polymer，2013，92（2）：1262-1279.

[7]Choi K Y，Yoon H Y，Kim J H，et al.Smart nanocarrier based on PEGylated hyaluronic acid for cancer therapy[J].ACS Nano，2011，5（11）：8591-8599.

[8]Bae K H，Choi S H，Park S Y，et al.Thermosensitive pluronic micelles stabilized by shell cross-linking with gold nanoparticles[J].Langmuir，2006，22（14）：6380-6384.

[9]Chen J X，Wang H Y，Li C，et al.Construction of surfactant-like tetra-tail amphiphilic peptide with RGD ligand for encapsulation of porphyrin for photodynamic therapy[J].Biomaterials，2011，32（6）：1678-1684.

[10]Chang C，Wei H，Feng J，et al.Temperature and pH double responsive hybrid cross-linked micelles based on P （NIPAAm-co-MPMA）-b-P（DEA）：RAFT synthesis and"Schizophrenic"micellization[J].Macromolecules，2009，42：4838-4844.