紫花牡荆素对卵巢癌OVCAR-3细胞系肿瘤球形成的影响

厉碧荣，李 劼，王静云，杨小红

(1.湖南师范大学第一附属医院，湖南省人民医院老年病科，湖南 长沙 410005;2.湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410006)

卵巢癌是全世界妇女死亡率最高的恶性肿瘤之一。尽管顺铂和紫杉醇等药物初次治疗具有高达80%的有效率，但是，高复发率和多药耐药等原因导致卵巢癌患者5年生存率不超过30%［1］。近来的研究表明，卵巢癌治疗后的高复发率和药物耐受性归因于现有化疗药物没有能够消除具有干细胞性质的卵巢癌细胞即卵巢癌干细胞样细胞［2］。卵巢癌干细胞样细胞的一个重要特征是具有自我更新即干细胞培养基超低粘附板培养肿瘤球形成能力［3］。

紫花牡荆素(casticin，CAS)系传统中药蔓荆子的主要抗肿瘤有效成分。有研究证实CAS 具有抑制肝癌干细胞和肺癌干细胞样细胞自我更新作用［4-5］。本文的研究检定CAS 能否有效抑制人卵巢癌OVCAR-3 细胞系肿瘤球形成，并探讨其作用的潜在机制是否涉及下调干细胞标志物CD44 蛋白表达。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

CAS 由湖南师范大学医学院曹建国教授惠赠，经高效液相色谱法测定纯度为0. 958。鼠抗人CD44 单克隆抗体为美国Cell signaling 公司产品;鼠抗人β-actin 单克隆抗体系美国Sigma 公司生产。

1.2 细胞系与成球培养

人卵巢癌OVCAR-3 细胞系细胞购自上海中国科学院细胞库(中国上海市)。参照文献［6］的方法进行常规单层贴壁细胞生长培养和干细胞培养基超低粘附板悬浮培养。

1.3 Western Blot 分析

按照文献［6］的方法制备全细胞提取物。Bradford 试验(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)测定蛋白质含量。以10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离提取的蛋白质，并转移至PVDF 膜。在PBST 中，用脱脂牛奶5%(w/v)进行封闭PVDF 膜，鼠抗人CD44 单克隆抗体作为一抗，4 ℃条件孵育过夜。用过氧化物酶标记的二抗孵育PVDF 膜1 h。以增强化学发光试剂盒(Amersham Biosciences)对信号进行检测。用鼠抗人β-actin 单克隆抗体作为加样量对照。

1.4 统计学分析

实验数据录入Spss15.0 for windows evaluation软件(SPSS Inc，Chicago，IL)，建立数据库，各组实验数据均用均数±标准差(mean ±SD)表示，用One Way ANOVA 方式行方差分析。各组均数间的两两比较用LSD 法。P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CAS 对卵巢癌OVCAR-3 细胞系肿瘤球形成的影响

体外人卵巢癌OVCAR-3 细胞系细胞呈单层贴壁生长(图1A)。干细胞培养基超低粘附板培养OVCAR-3 细胞系细胞6 天，形成非粘附克隆性三维细胞球体(图1B)，其肿瘤球形成率为3. 16%。CAS(1.0、3.0、10.0 μmol/L)作用48 h，有效减少OVCAR-3 细胞系肿瘤球形成数量(图1C)。

图1 紫花牡荆素抑制人卵巢癌OVCAR-3 细胞系肿瘤球形成(mean±SD，n=6)

2.2 人卵巢癌OVCAR-3 细胞系球形成细胞高表达CD44 蛋白

Western Blot 分析结果显示:与亲本细胞比较，人卵巢癌OVCAR-3 细胞系球形成细胞干细胞标志物CD44 蛋白表达水平增高(图2)，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。

图2 人卵巢癌OVCAR-3 细胞系球形成细胞与亲本细胞CD44 蛋白表达的比较(mean±SD，n=3)

2.3 CAS 对卵巢癌OVCAR-3 细胞系肿瘤球形成CD44 蛋白表达的影响

图3 可见:CAS(1.0、3.0、10.0 μmol/L)孵育24 h，人卵巢癌OVCAR-3 细胞系球形成细胞CD44 蛋白表达水平明显降低，呈浓度依赖性(P ＜0.05)。

图3 紫花牡荆素下调人卵巢癌OVCAR-3 细胞系球形成细胞CD44 蛋白表达(mean±SD，n=3)

3 讨论

新近的研究证实:人卵巢癌OVCAR-3 细胞系球形成细胞具有CD44 + CD24low细胞表型和自我更新、高致瘤性等卵巢癌干细胞样细胞特性［7］。与该研究结果相一致，在本文的实验研究中，我们采用干细胞培养基超低粘附板悬浮培养OVCAR-3 细胞系细胞6 天，得到非粘附克隆性肿瘤球形成细胞;并用Western Blot 分析证明OVCAR-3 细胞系球形成细胞高表达干细胞标志物CD44 蛋白。从而进一步证明OVCAR-3 细胞系球形成细胞具有卵巢癌干细胞样细胞特性。

CAS 是一种被证明具有抗肿瘤活性的多甲氧基黄酮类化合物［8］，新近的实验有研究提示CAS 能有效抑制肝癌干细胞样细胞和肺癌干细胞样细胞自我更新能力［4-5］。本文的研究结果显示，CAS 能有效人卵巢癌OVCAR-3 细胞系肿瘤球形成能力，突出了CAS 是一种靶向抑制肿瘤干细胞功能和特性候选药物的潜在应用前景。

已有研究提示细胞表面CD44 即透明质酸受体表达与肿瘤干细胞自我更新性质和药物耐受性相关［9］。本文用Western Blot 分析的结果证实，CAS以浓度依赖方式下调人卵巢癌OVCAR-3 细胞系球形成细胞CD44 蛋白表达。因此，我们作出如下推断:CAS 具有抑制人卵巢癌OVCAR-3 细胞系自我更新作用，其作用分子机制与下调干细胞标志物CD44 蛋白表达有关。

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