STAB1表达与多形性胶质母细胞瘤病人生存的关联

粟艳林，谌 思，李 悦，陈秋霞，彭小宁

(湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410006)

胶质母细胞瘤(GBM)是成人中最常见和最恶性的脑部肿瘤，占所有脑肿瘤的12% ～15%，占星形细胞瘤的50% ～60%。外科手术很难完全切除肿瘤病灶;化疗和放疗对肿瘤细胞没有高度特异性，并且具有严重的副作用。因此，GBM 患者预后往往很差。有资料表明GBM 患者在用手术、放疗和替莫唑胺等化疗药物的综合治疗后中位数生存时间仅为12 ～18 个月［1-2］。一个12 个随机临床实验的Meta分析表明GBM 患者的一年生存率只有40%，在增加辅助治疗后其生存率也只增长到46%。虽然GBM 的发病率相对较低，仅占所有肿瘤的2%，但GBM 在小于34 岁的人中死亡原因排第二，在35 ～54 岁的人中死亡原因排第三。GBM 在神经外科领域仍然是难以治疗的疾病，使得其成为重要的公共卫生问题。

早期发现新的靶向分子标志物将会成为降低GBM 死亡率的有效手段。目前，GBM 的分子病理学及其与GBM 之间的相关性鲜为人知，在GBM 中发现的一些分子畸变将可能成为诊断或预后的指标。如表皮生长的因子受体(EGFR)等癌基因的增加［3-6］，以及肿瘤抑制基因PTEN，P53 或p16/INK4A的缺失在GBM 中成为一些最常见的遗传改变［7-8］。最近的一项报道指出，异柠檬酸脱氢酶(IDH1)基因突变和MGMT 的甲基化与GBM 的预后相关［9］。然而，大多数分子的变化并不能证明其为GBM 的生物标志物，因为生物标志物应提供比组织学分型更加独特的诊断，预后或预测信息。

我们前期通过对GBM 的基因序列表达分析(SAGE)公共数据库的数据挖掘发现STAB1 在GBM 中具有特有的差异性表达［10］。本文我们通过对TCGA 数据库中的GBM 基因表达谱芯片数据的进一步挖掘及实验研究并验证STAB1 的表达与GBM 生存之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

用于数据挖掘的GBM 临床数据和基因表达谱芯片数据来源于TCGA 公共数据库，包含355 个GBM 病人(每个病人一份样品)。用于实验验证的GBM 组织样品来源于湖南省第二人民医院病理科1999—2012年间GBM 肿瘤31 例(术前无放化疗及手术史者)，全部病例经两位副主任以上病理医师重新审阅，具备详细的随访资料。兔多克隆抗人STAB1 抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司(SC-98788 )。NovoLinkTM 聚合物检测系统(RE7290 –K)购于英国纽卡斯尔Novocastra Laboratories。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片处理

利用R 中的affy 包并选取RNA 算法对affymetrix 基因芯片的原始数据做预处理和log2 转换获得探针的相对表达丰度信号。在探针对应基因名时选取表达最强的探针信号作为基因表达的信号。从全基因组表达谱矩矩阵中选取目标基因(STAB1)的表达向量。

1.2.2 免疫组织化学

GBM 组织标本及时用甲醛溶液固定，石蜡包埋并切成3μm 的切片。采用两步法检测STAB1 的表达。所有切片经脱蜡和梯度乙醇脱水，使用Novocastra Peroxidase Block RE7101 封闭内源性过氧化物酶后用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)冲洗，之后用柠檬酸盐缓冲液在微波中15 分钟以修复抗原，切片在室温下冷却20 min 后用双蒸水冲洗3 次，每次5 min。用Novocastra Protein Block(RE7102)封闭切片以减少非特异性染色。将切片滴加STAB1 兔多克隆抗体(1:300)后放湿盒内，37℃下2 小时。肝、胎盘组织切片作为阳性对照，用PBS 代替第一抗体作为阴性对照。一抗孵育后用PBS 洗涤3 次每次5min，切片滴加Novolink 聚合物(RE7200-K)湿盒内37℃孵育30min。PBS 洗涤3 次，每次5min，0.05%新鲜配制的DAB 显色，苏木素复染。最后，切片乙醇梯度脱水，干燥后封片。STAB1 阳性染色的定义为内皮细胞胞浆内棕色染色。

1.2.3 生存关联分析

单变量Cox 回归分析公共数据库中STAB1 的表达和GBM 病人生存之间的关联。生存分析比较实验中STAB1 阳性组和阴性组GBM 病人之间的生存期差异。所有统计分析采用R 2.15。

2 结果

2.1 STAB1 为GBM 预后危险因素

STAB1 在TCGA 公共数据库中355 例GBM 样品中的表达情况及GBM 病人生存时间的分布(见图1)。单变量Cox 回归分析发现STAB1 的表达显著与GBM 的生存期显著相关(HR=1.96，P=1.98e-04)为GBM 预后的一个危险因素(HR ＞1)。

对于每个GBM 病人根据其STAB1 的表达水平计算其预后指数(PI)，PIi=β ×Gi，其中β 为回归系数，Gi为STAB1 在地i 份样品中的表达水平。选取PI 的中位值作为门槛值，将GBM 病人分为高风险和低风险两群，生存分析发现高风险群的病人的生存时间显著低于低风险群的病人(见图3A)。

2.2 STAB1 阳性组病人的生存时间显著低于阴性组

免疫组织化学(见图2)发现26 份GBM 样品STAB1 高表达，5 份样品STAB1 低表达。生存分析发现GBM 病人STAB1 阳性表达组生存时间显著低于阴性表达组(见图3B)。

图1 STAB1 的表达向量(A)，GBM 病人生存时间(B)，单位为天，“+”表示结尾样品。

图2 免疫组化结果图STAB1 阴性组(A)STAB1 阳性组(B)

图3 高风险组的生存显著低于低风险组(A)，STAB1 阳性组的生存时间显著低于阴性组(B)。

3 讨论

之前有研究表明血管生成是癌症的重要特征之一［11］。STAB1 作为清道夫受体能乙酰化低密度脂蛋白，还可能通过与多种生长因子相互作用参与血管生成［12］。据我们所知，GBM 是新生血管形成最高的肿瘤之一，其转化、增殖、迁移和存活均需要血管生成［13］。通过免疫组化实验我们观察到STAB1在血管内皮细胞中有明显表达上调，这表明STAB1可能在GBM 增殖、迁移和存活中起十分关键的作用。目前使用抗血管生成治疗来抑制GBM 的生长已被广泛接受［14］，血管生成的抑制剂成为目前开发治疗GBM 药物的重点［15］。VEGF 和IL-6 等一些目前已知的重要的基因与血管发生有相关性，但我们在之前的研究中发现，与正常组织对比，这些基因在GBM 和星形细胞瘤中有显著上调改变，但在没有发现两者之间有差异性改变，这意味着VEGF 和IL-6在脑胶质瘤中可能是较常见的血管生成因子，并非特异性表达血管生成因子。我们先前的研究表明STAB1 在最恶性的神经胶质瘤GBM 中可能是血管生成的加速器［10］。在GBM 病人中，STAB1 阳性表达组生存时间显著低于阴性表达组，结合STAB1 潜在促进血管生成的功能，本文从临床关联的角度进一步说明STAB1 在GBM 中的重要性。

［1］Pfister S，Janzarik W G，Remke M，et al. BRAF gene duplication constitutes a mechanism of MAPK pathway activation in low-grade astrocytomas［J］. J Clin Invest，2008，118(5):1739-1749.

［2］Riemenschneider MJ，Jeuken JWM，Wesseling P，et al. Molecular diagnostics of gliomas:state of the art［J］. Acta neuropathol，2010，120(5):567-584.

［3］Parsons D W，Jones S，Zhang X，et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme［J］. Science，2008，321(5897):1807-1812.

［4］Velculescu V E，Zhang L，Zhou W，et al. Characterization of the yeast transcriptome［J］. Cell，1997，88(2):243-251.

［5］Murray D，Doran P，MacMathuna P，et al. In silico gene expression analysis-an overview［J］. Mol Cancer，2007，6(1):50.

［6］Tuteja R，Tuteja N. Serial analysis of gene expression:applications in human studies［J］. J Biomed Biotechnol，2004，2004(2):113-120.

［7］Lauriola M，Ugolini G，Rosati G，et al. Identification by a Digital Gene Expression Displayer (DGED)and test by RT-PCR analysis of new mRNA candidate markers for colorectal cancer in peripheral blood［J］. Int J Oncol，2010，37(2):519-525.

［8］Ossandon FJ，Villarroel C，Aguayo F，et al. In silico analysis of gastric carcinoma Serial Analysis of Gene Expression libraries reveals different profiles associated with ethnicity［J］. Mol Cancer，2008，7(1):22.

［9］Aung P P，Oue N，Mitani Y，et al. Systematic search for gastric cancer-specific genes based on SAGE data:melanoma inhibitory activity and matrix metalloproteinase-10 are novel prognostic factors in patients with gastric cancer［J］. Oncogene，2005，25(17):2546-2557.

［10］Su Y，Xiong J，Bing Z，et al. Identification of novel human glioblastoma-specific transcripts by serial analysis of gene expression data mining［J］. Cancer Biomarkers，2013，13(5):367-375.

［11］Hanahan D，Weinberg R A. Hallmarks of cancer:the next generation［J］. Cell，2011，144(5):646-674.

［12］Adachi H，Tsujimoto M. FEEL-1，a novel scavenger receptor with in vitro bacteria-binding and angiogenesis-modulating activities［J］.J Biol Chem，2002，277(37):34264-34270.

［13］Bögler O，Mikkelsen T. Angiogenesis in glioma:molecular mechanisms and roadblocks to translation［J］. Cancer J，2003，9(3):205-213.

［14］Bögler O，Mikkelsen T. Angiogenesis and apoptosis in glioma:two arenas for promising new therapies［J］. J Cell Biochem，2005，96(1):16-24.

［15］Weller M，Stupp R，Hegi M，et al. Individualized targeted therapy for glioblastoma:fact or fiction?［J］. Cancer J，2012，18(1):40-44.