大肠杆菌代谢工程生产芳香族化合物研究进展*

李飞飞，赵广荣

(天津大学化工学院制药工程系，天津，300072)

芳香族化合物广泛应用于化工、饲料、食品和医药等领域，其主要的来源是石油和煤焦油工业，化学合成是工业上生产芳香类化合物普遍采用的方法。芳香族化合物也广泛分布于自然界，是各种生物的初级和次级代谢产物，所以也有一部分芳香族产品是通过生物法获得的。近年来，随着环保要求的提高和化石能源的减少，利用生物法合成芳香族目标化合物成为研究的热点，其中微生物发酵法是通过优良的微生物菌种在合适的条件下以葡萄糖、甘油等可再生原料发酵积累芳香族化合物。目前对于微生物中芳香族化合物的合成途径和调控机理研究最多且阐述最为清楚的是大肠杆菌。

大肠杆菌体内芳香族化合物的合成主要通过莽草酸途径(shikimate pathway)(图1)和其下游芳香族氨基酸进一步衍生化实现。由于大肠杆菌自身积累芳香族化合物能力很低，只有代谢途径优化改造才能更好的实现目标产物的发酵生产。近几年通过大肠杆菌代谢工程方法生产芳香族化合物取得了显著成效，极大地提高了目标化合物的合成积累能力，这为日后研究的进一步深入和工业化生产奠定了良好的基础。

1 莽草酸途径及莽草酸生物合成

如图1所示，莽草酸途径是所有芳香族化合物合成共有的，合成的起始物是赤藓糖-4-磷酸(E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHP合成酶)催化下生成DAHP，后其经过3步酶催化形成莽草酸(shikimate)，途径终产物为分支酸(chorismic acid，CHA)，以分支酸为前体分别合成L-酪氨酸和L-苯丙氨酸，及L-色氨酸。3种芳香氨基酸可经不同酶催化得到多种的芳香族衍生物。莽草酸途径是下游芳香族化合物合成的前提，其代谢通路是否畅通直接影响到下游目标化合物的产量。对于途径的改造多集中于增加来自于糖酵解途径(glycolytic pathway)PEP和磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)E4P前体的供应，DAHP合成同工酶基因突变以抗反馈抑制，途径中负调控基因的敲除和竞争途径的阻断，以及途径中的关键酶的过表达等［1］。

莽草酸是生产抗病毒药物达菲重要的原料，目前主要从植物中提取获得。Gosset等［2］通过在缺失磷酸转移酶系统(Phosphotransferase system，PTS)和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，Pyk)的大肠杆菌体内过表达戊糖磷酸途径和莽草酸途径的6个基因，以葡萄糖为碳源培养基分批补料发酵30 h，莽草酸产量达到43 g/L。Escalante 等［3］利用缺失 PTS、aroK、aroL、pykF或pykA及 过表达aroG、tktA、aroB和aroE的大肠杆菌生产 SA，产量达7 g/L，产率达0．29 mol/mol。Zhou 等［4］利用过表达 tktA、glk、aroE 和 aroB 基因，并敲除aroK、aroL、ptsHIcrr和ydiB基因的大肠杆菌，10 L发酵罐发酵，SA积累产量达到1 850 mg/L。

2 L-酪氨酸衍生物大肠杆菌代谢工程合成

由莽草酸途径终产物分支酸出发，经过分支酸变位酶(Chorimate mutase)TyrA和PheA催化，得到预苯酸(prephenic acid，PA)，预苯酸在预苯酸脱氢酶(prephenate dehydrogenase)作用下得到4-羟基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate)，4-羟基苯丙酮酸在 L-酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase)TyrB或AspC作用下通过与L-谷氨酸的转氨作用生成L-酪氨酸。L-酪氨酸是人和动物新陈代谢、生长发育重要的、必需的氨基酸。通过代谢工程构建高产L-酪氨酸的工程大肠杆菌，微生物发酵法生产L-酪氨酸成为近几年的热点［1］。

图1 芳香氨基酸生物合成途径Fig．1 Biosynthesis pathway of aromatic amino acid

L-酪氨酸作为很好的平台化合物，以其为前体利用大肠杆菌发酵转化可以得到多种广泛用途的化学品，如图2所示，其衍生物包括对羟基苯乳酸、对羟基苯乙酸、对羟基苯乙醇、L-多巴、丹参素、黑色素、咖啡酸、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯，苯酚，对羟基苯甲酸等。

图2 通过大肠杆菌代谢工程合成L-酪氨酸相关衍生物Fig．2 L-tyrosine derivatives synthesized by metabolic engineering of Escherichial coli

4-羟基苯乳酸(4-hydroxyphenyllactic acid，HPL)是合成新型糖尿病药物和混杂多肽的关键中间体，4-羟基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid，HPA)可用于合成β-受体阻滞药阿替洛尔和葛根黄豆甙元有效成分4，7-二羟基异黄酮的合成，4-羟基苯乙醇(4-hydroxyphenethylalcohol，HPAL)可用于合成心血管药物美多心安。Sakai等［5］将来自 Cupriavidus necator的乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase)基因整合到L-酪氨酸高产菌株染色体上表达，得到4-羟基苯乳酸;将来自Azospirillum brasilense的苯丙酮酸脱羧酶(Phenylpyruvate decarboxylase)基因ipdC和Escherichial coli的苯乙醛脱氢酶(Phenylacetaldehyde dehydrogenase)基因feaB整合到L-酪氨酸高产菌株染色体上表达，得到4-羟基苯乙酸;将ipdC和来自Lactobacillus brevis的乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)基因整合到染色体上表达，得到产4-羟基苯乙醇。

多巴(L-3，4-dihydroxyphenylalanine ，L-DOPA)是一种治疗帕金森症的芳香族化合物。Gosset等［6］表达来自于Escherichial coli的抗反馈抑制DAHP合成酶、转酮醇酶、分支酸变位酶和来自于 Zymomonas mobilis的环己二烯脱氢酶(Cyclohexadienyl dehydrogenase)得到高产L-酪氨酸菌株，进一步表达大肠杆菌4-羟基苯乙酸3-羟化酶(4-Hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，HpaBC)实现 L-酪氨酸向 L-多巴转化，发酵50 h时L-多巴产量达到1．51 g/L。

丹参素(salvianic acid A，SAA)是一种酚酸类化合物，可用于胸憋闷、心绞痛治疗等，其主要来源是药用植物丹参中提取。YAO等［7］通过模块化代谢工程双启动子过表达L-酪氨酸合成途径中6个关键基因得到高产L-酪氨酸大肠杆菌，并在此基础上引入D-乳酸脱氢酶(D-lactate dehydrogenase)和4-羟基苯乙酸3-羟化酶，实现丹参素的合成，产量达到7．1 g/L，转化率达到 0．47 mol/mol。

黑色素(melanin)是动物皮肤或毛发中存在的一种黑褐色的色素，可以保护机体避免受紫外线的伤害，其合成主要通过酪氨酸酶(Tyrosinase)对L-酪氨酸的转化实现，Gosset等［8］缺失PTS系统和tyrR基因，同时表达编码来自Rhizobium etli的酪氨酸酶的melA基因，大肠杆菌以葡萄糖为碳源发酵120 h黑色素产量达到3．22 g/L。

咖啡酸(caffeate)具有收缩增固微血管、提高凝血因子、升高白细胞和血小板的作用，同时它还具有抗炎和抗肿瘤的作用，是医药的重要原料和中间体。Stephanolpoulos等［9］通过优化不同的途径、基因拷贝数、培养基等条件，从L-酪氨酸合成咖啡酸，产量达106 mg/L。YAN Yajun 等［10］在高产 L-酪氨酸大肠杆菌中表达4-羟基苯乙酸3-羟化酶并优化接种时间，发酵咖啡酸产量达到766．68 mg/L。

4-羟基苯乙烯(4-hydrostyrene)可用作高性能聚合物材料光刻胶单体。Sariaslani等［11］利用1株表达来自Rhodotorula glutinis L-酪氨酸氨解酶(Tyrosine ammonia-lyase)和来自Lactobacillus plantarum对香豆酸脱氢酶(4-coumaric acid decarboxylase)大肠杆菌，实现L-酪氨酸经对香豆酸(4-coumalic acid，4CA)向4-羟基苯乙烯转化，在14L发酵罐磷酸盐限制型碳源培养基发酵，4-羟基苯乙烯产量达到0．4 g/L。

图3 由大肠杆菌代谢工程合成的L-苯丙氨酸(a)和L-色氨酸(b)相关衍生物Fig．3 Derivatives of L-phe(a)and L-try(b)synthesized by metabolic engineering of Escherichial coli

苯酚(phenol)是重要的有机化工原料，在树脂、合成纤维、合成橡胶、杀菌剂、防腐剂、染料以及医药等工业领域有着重要用途，医疗上也用于外科器械或皮肤的杀菌消毒。Lee等［12］在大肠杆菌中利用SRNA技术抑制负调控基因，过表达L-酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol-lyase)，利用葡萄糖生产苯酚，菌株摇瓶发酵最高产量达到419 mg/L，补料分批发酵产量达1．69 g/L。苯酚由于其对微生物的毒性，限制了其发酵积累，通过两相补料分批发酵21 h配合甘油三丁酸酯萃取苯酚产量和产率分别提高至3．79 g/L和 0．18 g/(L·h)。

对羟基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid，HBA)是重要的有机合成原料，还广泛用于食品、化妆品、医药的防腐防霉和杀菌等方面。Frost等［13］过表达抗反馈抑制的DAHP合成酶和3-脱氢奎尼酸合成酶，再由ubiC编码的分支酸裂解酶将分支酸转化为对羟基苯甲酸，以葡萄糖为碳源最高产量达12 g/L，产率为0．13 mol/mol。

3 L-苯丙氨酸及其衍生物

3.1 大肠杆菌代谢工程合成L-苯丙氨酸

预苯酸经PheA催化得到苯丙酮酸，苯丙酮酸经过AspC、TyrB转氨酶催化得到L-苯丙氨酸。L-苯丙氨酸是人体必需氨基酸之一，医药工业上可作为复配氨基酸输液的重要成份，是苯丙氨苄、甲酸溶肉瘤素等氨基酸类抗癌药物的中间体，也是生产肾上腺素、甲状腺素的原料;在食品工业上用作合成甜味剂阿斯巴甜。此外，L-苯丙氨酸相关的芳香族衍生物的大肠杆菌代谢工程合成也取得了很多进展，如图3a。

陈坚等［14］通过亚硝基胍诱变得到具有Thr326Pro突变的PheA，突变的大肠杆菌同时共表达aroF基因，在3 L发酵罐中产量达到35．38 g/L，比原始菌株高2．81倍，产率达到0．26 mol/mol，是原始菌株2倍。Packdibamrung等［15］大肠杆菌中表达来自于Thermotolerant bacillus lentus的L-苯丙氨酸脱氢酶(Phenylalanine dehydrogenase)、芳香氨基酸外转运基因yddG和编码甘油转运辅因子基因glpF，甘油作为碳源5 L发酵罐发酵L-苯丙氨酸产量达到366 mg/L。

3.2 大肠杆菌代谢工程合成L-苯丙氨酸衍生物

扁桃酸(mandelate)是药物合成重要的原料，可用于头孢羟唑、血管扩张药环扁桃酯、滴眼药盐酸羟苄唑、匹莫林等的合成。杨晟等［16］通过大肠杆菌对L-苯丙氨酸合成途径基因改造实现以葡萄糖为碳源合成光学纯的扁桃酸。通过引入Amycolatopsis orientalis的对羟基扁桃酸合成酶(Hydroxymandelate synthase)得到S-扁桃酸产量0．092 g/L的工程菌。敲除竞争途径基因tyrA，24 h产量达到0．74 g/L。在S-扁桃酸生产菌株中共表达天蓝色链霉菌对羟基扁桃酸氧化酶(Hydromandelate oxidase)和Rhodotorula graminis D-扁桃酸脱氢酶(D-mandelate dehydrogenase))，可生产 R-扁桃酸 0．68 g/L。

苯乙烯(styrene)是合成树脂、离子交换树脂及合成橡胶等高分子聚合物材料的重要单体。David等［17］在大肠杆菌中共表达从细菌，酵母，植物中筛选L-苯丙氨酸氨解酶(Phenylalanine ammonia-lyase)和反式肉桂酸脱羧酶同工酶，实现由內源L-苯丙氨酸向苯乙烯的转化。最终选择在L-苯丙氨酸高产大肠杆菌工程菌种过表达来自于Arabidopsis thaliana的L-苯丙氨酸氨解酶和来自于Saccharomyces cerevisiae的阿魏酸脱羧酶(Ferulate decarboxylase)摇瓶发酵产量达到260 mg/L，接近苯乙烯毒性极限。

D-苯甘氨酸(D-phenylglycine)是半合成青霉素类和头孢菌素类抗生素重要的侧链单元。Muller等［18］从L-苯丙氨酸前体苯丙酮酸起始，人工构建了一条新的D-Phg合成途径，由分别来自Amycolatopsis orientalis，Streptomyces coelicolor和 Pseudomonas putida的3种酶对羟基扁桃酸合成酶(Hydroxymandelate synthase)，对羟基扁桃酸氧化酶(Hydroxymandelate oxidase)和D-对羟基苯甘氨酸氨基转移酶 (Hydroxyphenylglycine aminotransferase)组成，将苯丙酮酸经过扁桃酸，苯乙酮酸转化为D-苯甘氨酸。

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)是可以抑制腐败菌、致病菌，特别是对真菌的感染，有望成为一种新型的防腐剂应用于食品工业及药物制剂;苯乙酸(phenylacetic acid，PAA)在医药工业中用于青霉素、地巴唑等药物合成，还可用作生产广谱有机磷杀虫剂农药，合成香料等;苯乙醇(phenethylalcohol，PA)可作为食用香料，也在化妆品、香皂中经常应用，还可作为眼药水中的抗菌成分。Sakai等［5］利用跟高产L-酪氨酸菌株生产对羟基苯乳酸，对羟基苯乙酸，对羟基苯乙醇同样的基因表达及生产策略，将基因整合到高产L-苯丙氨酸基因组上，可以得到苯乳酸，苯乙酸，苯乙醇生产菌株。

4 L-色氨酸及其衍生物

4.1 大肠杆菌代谢工程合成L-色氨酸

分支酸在氨基苯甲酸合成酶作用下与L-谷氨酰胺(L-glutamine)发生转氨作用生成邻氨基苯甲酸(2-aminobenzoic acid，ABA)，后其经过多步酶促反应生成含五元杂环的芳香族化合物吲哚(indole)，吲哚与丝氨酸(serine)在色氨酸合成酶催化下最终生成L-色氨酸。色氨酸是是人体必需的氨基酸之一，作为营养增补剂用于食品工业;用于烟酸缺乏症治疗药及调节精神节律安神药用于医药领域，另外L-色氨酸还大量应用于饲料工业。L-色氨酸生产菌株通常通过传统的诱变育种筛选，但有益突变频率低，变异的方向和性质难控制，因此通过代谢工程理性设计以提高其产量逐渐成为研究热点，并拓展到与色氨酸代谢途径相关的芳香族衍生物，如图3b。

祁庆生等［19-21］在产 L-色氨酸工程大肠杆菌体内导入可以改变胞内代谢通路和氧化还原状态的聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate)途径，有效地增加了L-色氨酸产量，达到14．4 g/L。通过构建 L-色氨酸通透酶Mtr，TnaB，AroP突变菌株，抑制大肠杆菌对L-色氨酸的吸收转运，增加胞外发酵液中的L-色氨酸浓度至16．3 g/L。通过过表达tktA和突变的trpE和aroG基因及阻断一系列竞争途径得到原始产L-色氨酸菌株，后通过一步法弱化子失活和启动子对换策略对代谢通路优化，其产量比原始产L-色氨酸菌株分别高1．67和9．29倍，48 h发酵罐发酵最高产量达到10．15 g/L。

陈坚等［22］通过定点突变消除AroF和邻氨基苯甲酸合成酶(TrpED)的受到的反馈抑制，并在温度诱导的表达型质粒pSV上表达两突变基因。敲除trpR基因解除trp抑制子的转录调控，敲除pheA、tyrA和tnaA基因分别阻断L-苯丙氨酸、L-酪氨酸途径与L-色氨酸途径的竞争及其降解，最终发酵L-色氨酸产量达到13．3 g/L。

陈宁等［23-25］通过修饰芳香氨基酸分泌基因yddG和芳香氨基酸透过酶AroP构成的L-色氨酸转运系统，影响L-色氨酸的生产和细胞生长，使得L-色氨酸合成代谢流重新分配。最优化的工程菌株在30 L发酵罐中补料分批发酵L-色氨酸产量达36．3 g/L。通过敲除大肠杆菌pta和mtr基因，并过表达yddG基因，30 L发酵罐发酵 L-色氨酸最大产量可达48．68 g/L。通过过表达ppsA和tktA，增加胞内PEP和E4P供应，分批发酵40 h L-色氨酸产量达到35．9 g/L。

4.2 大肠杆菌代谢工程合成L-色氨酸衍生物

吲哚3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，又称生长素，对于植物的生长发育具有重要作用。Romasi等［26］在大肠杆菌中表达 aspC，ipdC和 iad1三个基因，分别编码来自于Escherichia coli、Enterobacter cloacae和Ustilago maydis的氨基转移酶、吲哚3-丙酮酸脱羧酶和吲哚-3-乙酸脱氢酶。tac启动子控制表达ipdC和iad1及来自于Corynebacterium glutamicum的sod启动子控制表达aspC，重组大肠杆菌在添加2 g/L L-色氨酸LB培养基发酵48 h，IAA产量约1．1 g/L，进一步敲除抑制L-色氨酸生成的tnaA基因，IAA产量增至1．8 g/L。当添加4 g/L L-色氨酸至LB培养基发酵24 h，IAA 产量达3．0 g/L。

靛红(indirubin)和靛蓝(indigo)是应用广泛的还原染料，用于食品、医药和日用化妆品的着色。Han等［27］在大肠杆菌中表达来自于 Methylophaga aminisulfidivorans的黄素单加氧酶(Flavin-containing monooxygenase)，并在5 L含2 g/L L-色氨酸的培养基中发酵，得到920 mg/L靛蓝和5．0 mg/L靛红。培养基中进一步添加0．36 g/L的半胱氨酸，半胱氨酸会影响黄素单加氧酶的区域选择性，增加靛红前体2-羟基吲哚的合成，利用优化培养基发酵靛红产量达到223．6 mg/L。

紫色杆菌素(violacein)和脱氧紫色杆菌素(deoxyviolacein)具有很好的生物活性，可以作为潜在的抗肿瘤、抗病毒药物及生物染料。Wittmann等［28］在大肠杆菌中表达来自于Chromobacterium violaceum的vioABCE基因簇，可以积累脱氧紫色杆菌素达180 mg/L，进一步通过胞内代谢分析找到丝氨酸、分支酸和色氨酸生物合成及磷酸戊糖途径瓶颈，并进行系统改造，摇瓶发酵脱氧紫色杆菌素积累量增至320 mg/L。将来自于Janthinobacterium lividum的vioD基因整合到工程大肠杆菌基因组上，紫色杆菌素成为唯一的终产物，补料分批发酵其产量达710 mg/L。

血清素(serotonin)是一种植物源的生物碱，具有潜在的药理作用。Sangkyu等［29］在含有GST(Glutathione S transferase)标签蛋白的质粒pCOLADuet-1上融合表达色胺5-羟化酶(Tryptamine 5-hydroxylase)，使其在大肠杆菌中具有活性，并同时共表达色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase)，在约20℃诱导表达融合蛋白可有最高的可溶性，此时血清素产量达24 mg/L。

5 展望

随着化石资源的枯竭，化石能源基产品需要寻求新的可持续替代来源;天然产物提取因受到季节地域成本等影响，其发展也有很大的局限性。芳香族化合物作为在医药，食品，化妆品，化工等各领域具有重要作用的产品，其来源也需要我们重新思考。单纯传统微生物育种已经遇到生产能力无法提高的瓶颈，也不能满足人们对发酵产品多样性的需求。必须与现代工业生物技术相结合，以发挥微生物发酵的优势。

代谢工程通过重新合理设计和优化微生物的代谢途径来更好地实现目标产物的发酵生产，广泛应用于微生物的改造取得了显著成效。近年来，随着各种组学的发展，对于全细胞尺度的基因组、转录组、蛋白质组和代谢组调控机理研究得越来越清晰，加之合成生物学理论的提出，从原件、模块、系统不同层次设计特定功能合成的生命体成为未来的趋势。在大肠杆菌等模式生物研究基础之上，不断优化并构建高产高效微生物细胞工厂，再结合工业微生物发酵和过程技术，最终实现产业化，促进经济社会可持续发展。

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