氢氧化铝佐剂氨水法配制工艺优化

胡高翔 毕跃东 吴永超 徐恒 秦敏*

(1.四川大学生命科学学院 四川成都 610064;2.成都生物制品研究所有限责任公司 四川成都 610023)

氢氧化铝是国际通用的人用疫苗佐剂[1],用于疫苗制备,其功能主要是吸附小分子的抗原,提高其免疫原性,其质量对最终产品的效力和不良反应均有直接影响。对机体而言,氢氧化铝佐剂是外源性物质,除了所需要的免疫刺激作用外,还可能引起副作用。造成副作用的原因可能与佐剂质量有关系,这就促使我们需要优化配制工艺,加强质量控制,减少批间差异。

氢氧化铝佐剂主要采用氨水法(氯化铝加氨水)和氢氧化钠法[2](氯化铝加氢氧化钠)制备,两法配制工艺不同,所涉及的质量体系也不同,本公司主要采用氨水法配制。本文将用氨水法优化前后各配制的5批进行对比。(批号见“结果”项)

1 材料和方法

1.1 主要试剂

(1)结晶氯化铝(AlCl3.6H2O):分析纯,广东光华有限公司制造,本所QC质检合格。(2)氨水:分析纯,成都长联化工试剂有限公司,本所QC部门质检合格。(3)纳氏试剂(Nessler):天津基准化学试剂有限公司。

表1 优化前后的氨水使用量

表2 灭菌后的pH检测结果

表3 平均粒径检测结果

1.2 配制优化

1.2.1 配制方法

将一定浓度的三氯化铝溶液加入到配制罐中,用一定浓度的氨水滴定,直至反应终点,溶液pH检测合格后,分装于透析袋中透析,透析溶液氨含量检测合格后,收集于配制罐内,搅拌均匀后分装,高压灭菌,室温保存。

1.2.2 设备校准

校准罐内温度传感器和在线pH探头,用转速仪校准搅拌转速。

1.2.3 用具标化

配制溶液的用具均标化。

1.2.4 配制工艺优化

(1)三氯化铝除菌过滤:结晶氯化铝用新鲜注射用水配制成适宜浓度的三氯化铝溶液,通过0.22um除菌滤芯过滤至配制罐,去除纤毛过滤异物。(2)氨水除菌过滤:通过0.22um除菌滤芯过滤后滴加入配制罐,去除纤毛过滤异物。(3)转速:提高搅拌转速,优化前为60转/min,优化后为80转/min。(4)反应温度:优化前温度在一定范围波动,优化后恒温63℃。(5)加样速度调整:优化前氨水按200mL/min向三氯化铝溶液里滴加,直至反应终点。优化后先按150mL/min滴加,观察在线pH变化,pH达到5.0后,降为50mL/min,直至反应终点。(6)无菌分装:无菌操作将配制溶液分装于透析袋,每袋装量为600mL。优化前,每袋装量不固定。(7)透析:根据透析槽大小,计算透析袋悬挂数量,透析袋悬挂后使用新鲜注射用水透析。

1.3 质量检测

分别取优化工艺前和优化工艺后生产的连续五批氢氧化铝佐剂按照下列项目进行质量检测。

(1)氨含量检测:采用显色、比色法进行检测:硫酸铵与碱性的纳氏试剂作用,生成棕色胶体溶液;先用标准硫酸铵溶液进行显色反应,反应后的颜色为对照,再用佐剂进行显色反应,然后比色,佐剂颜色比对照颜色浅,判定合格。(2)pH检测:pH计检测灭菌后佐剂的pH。(3)粒径大小检测:使用欧美克LS-pop6粒径检测仪测定灭菌后的佐剂粒径。(4)沉降速度的测定:按照《欧洲药典》[3]的检测方法,将灭菌后的佐剂进行沉降率的检测。(5)内毒素检测:按照《欧洲药典》的检测方法,将灭菌后的佐剂进行内毒素的检测。(6)无菌检测:按《中国药典》三部(2010版)[4]要求,对佐剂进行无菌试验。

表4 沉降率检测结果

2 结果

2.1 氨水使用量比较

在三氯化铝溶液量恒定的前提下,到达反应终点后,优化工艺后的氨水使用量批间差异小,变异系数仅0.36%,远小于优化工艺前的5.59%,详见表1。

2.2 氨含量检测结果比较

优化前五批佐剂,透析后和灭菌后氨含量检测均＜1/1000;优化后五批,透析后和灭菌后氨含量检测＜1/5000,可见透析效果增强。

2.3 pH检测

检测灭菌后佐剂的pH,优化后pH在4.7±0.2范围内,优化前pH在4.17-5.05,变化大,详见表2。

2.4 粒径检测结果

优化前5批佐剂的平均粒径分布在517-950nm之间,而优化后5批佐剂的平均的粒径分布在275-435nm之间,平均粒径变小,详见表3。

2.5 沉降率结果

佐剂沉降率结果为上清液体积<20ml判为合格,优化后5批沉降率结果合格率为100%,大于优化前5批40%的合格率,详见表4。

2.6 内毒素检测

优化后5批佐剂进行内毒素的检测,结果均为内毒素<5IU/mg铝,合格率100%,符合《欧洲药典》的规定,大于优化前5批40%的合格率。

2.7 无菌试验

优化后5批佐剂外观均为蓝白色悬液,抽样进行无菌试验,结果均为无菌生长,符合《中国药典》的规定。

3 讨论

理论上佐剂粒径大小与化学反应物的反应浓度,罐搅拌速度,反应温度等有关。生产工艺从以上方面优化后,佐剂批间差异小,平均粒径的大小分布在275～435nm。研究表明[5],颗粒越小,比表面积就大,表面反应活性越高,吸附能力可能越强。槐丽萍等[6]证实,氢氧化铝佐剂粒径大小与白喉类毒素的吸附效果及免疫原性密切相关。

氢氧化铝佐剂是外源性物质,免疫应答的同时可能引起副作用,增加佐剂内毒素检测和无菌试验,有助于保证佐剂的安全性,保障人体安全。

《欧洲药典》对氢氧化铝佐剂有明确的质量标准规定,而《中国药典》三部(2010版)对氢氧化铝佐剂的质量标准无明确规定,优化后的氢氧化铝佐剂符合《欧洲药典》某些检测项目的要求,但还需要完善其吸附能力的研究,为氨水法配制的氢氧化铝佐剂相关质量标准的建立奠定基础。优化后的配制工艺加强了质量风险控制,减少了批间差异,减少热源进入制品的机率,保证佐剂质量。

[1]张延龄.疫苗学[M]北京:科学出版社,2004:613-614.

[2]李德娟,何巍,张睿,等.氢氧化铝佐剂配制工艺优化[J].中国生物制品学杂志,2010,23(10):1135-1137.

[3]Directorate for the Quality of Medicines &HealthCare of the Council of Europe.The European Pharmacopoeia7.0[S].Framce:Strasbourg Cedex,2008:1664.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:附录89-附录92.

[5]何萍,吕凤林,任建敏,等.铝佐剂机制及其纳米化前景[J].世界华人消化杂志,2003,11(11):1764-1768.

[6]槐丽平,刘辉,张楠,等.不同粒径氢氧化铝佐剂对白喉类毒素免疫效果的影响[J].微生物学免疫学进展,2011,39(3):15-17.