导致酱油胀袋微生物的分离与鉴定*

张小丽，蒋予箭，李锋

1(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江杭州，310018)

2(至味食品有限公司，浙江绍兴，312050)

酱油是以黄豆(或豆粕)、小麦(或面粉、麸皮)为主要原料经微生物发酵酿制而成的一种调味品［1］。酱油富含氨基酸、糖分等营养物质，如果生产过程中原料、容器或管道灭菌不彻底，灌装及储存过程中管理不善，容易使产品感染杂菌，导致酱油胀袋，特别是在春夏季环境气温高、湿度大时容易发生［2］。酱油胀袋不仅给生产企业带来直接的经济损失，也严重影响到企业的信誉［3］。

未灭菌的酱油中含有多种微生物，细菌有芽孢杆菌、片球菌、乳酸菌等，其中芽孢杆菌的含量占首位［4］;酵母菌有耐高渗酵母菌、产膜酵母等;霉菌有黄曲霉、米曲霉等。对酱油进行巴氏杀菌很难将那些耐性很强的微生物杀死，很容易残留些产酸、产气的微生物而导致酱油胀袋。若能明确找到并鉴定出导致酱油胀袋的微生物，进而了解微生物的特性，可以在很大程度上帮助企业解决酱油胀袋问题。很多文献中显示，导致酱油胀袋的微生物是酵母菌，也有文献指出是乳酸菌和芽孢杆菌［5-6］，可见导致酱油胀袋的微生物不尽相同。本文利用细菌和真菌培养基对产自浙江绍兴地区的胀袋酱油进行微生物分离，通过产气验证实验找到导致酱油胀袋的微生物，然后再对该微生物进行鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料

浙江绍兴某厂提供的胀袋酱油、正常酱油、未调配酱油(原油)。

1.2 培养基

1.2.1 营养琼脂培养基

蛋白胨 10.0 g，牛肉浸膏 5.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水 1 L，pH7.2 ～7.4，121℃灭菌 20 min。用于分离和保存细菌。

1.2.2 MRS 培养基［7］

蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏10.0 g，酵母浸膏5.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐温 80 1.0 g，K2HPO42.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Mn-SO4·4H2O 0.05 g，CaCO310.0g，蒸馏水 1 L，pH 6.0～6.5。用于分离和保存乳酸菌。

1.2.3 高糖培养基［3］

酵母粉 10.0 g，葡萄糖500～600.0 g，NaCl 5.0 g，氯霉素 0.1 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 L，121 ℃灭菌20 min。用于分离酵母菌。

1.2.4 马铃薯蔗糖培养基

每升蒸馏水中含马铃薯(去皮切块)300.0 g，葡萄糖20.0 g，氯霉素0.1 g，琼脂20.0 g，将马铃薯去皮切块，加1 000 mL蒸馏水，水煮10～20 min，用纱布过滤，补加蒸馏水至1 000 mL，121℃灭菌15～20 min。用于分离霉菌和保存霉菌、酵母菌。

1.2.5 产气验证培养基

酱油原油50 mL，蒸馏水50 mL，pH 5.5，加入杜氏管，115℃灭菌20 min。

1.3 主要仪器和设备

AR-2140电子分析天平，奥豪斯国际贸易有限公司;隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司;Nikon E100生物显微镜，上海泽途机电设备有限公司;YXQ-LS-SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;pHS-3C型酸度计，梅特勒-托利多仪器有限公司;SW-CJ-1FD超净工作台和GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.4 实验方法与步骤

1.4.1 微生物的分离与纯化

根据文献，胀袋酱油中的菌落总数 ＜102CFU/mL［5］，在分离微生物时只需要做到 10-1稀释度。无菌条件下，将胀袋酱油样品充分混匀后，吸取10 mL于90 mL无菌生理盐水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇5 min制成菌悬液，稀释成100、10-1两个浓度梯度。在无菌条件下准确吸取不同浓度的菌液0.1 mL，分别加入装有不同培养基的培养皿上，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻涂布均匀［8］。每个稀释度做3个平行实验，并做空白对照。MRS培养基用无菌封口膜封培养皿，以制造无菌环境。细菌在37℃培养24 h;酵母菌在28℃培养3～4 d;霉菌在28℃培养5～7 d。

观察结果，将菌落形态不同的菌种分离，各自传代培养，至少进行3次传代分离，得到纯化菌种，标上记号，斜面保存菌种备用［9］。

1.4.2 产气微生物的验证

将已编号微生物接种到分离用培养基的液体培养基中，按相应条件培养1～2 d制备菌悬液;在无菌条件下用移液枪吸取一定量的菌悬液，加到灭菌后的产气验证培养基的试管中，使溶液中菌浓度为106～107CFU/mL;每种菌3个平行，用接入无菌生理盐水做空白对照［10］。细菌37℃，霉菌和酵母菌28℃恒温培养7～14 d，观察小导管中是否有气泡;若有气泡则为产气微生物。同时，用胀袋酱油作为对照，来检验结果准确性，无菌条件下吸取1 mL酱油加到装有小导管的5 mL产气培养基试管中，37℃恒温培养7～14 d观察结果。

1.4.3 产气微生物的鉴定

细菌通过观察菌落特征、菌体形态与大小以及革兰氏染色、芽孢染色、运动特性等，并做对温度、pH、NaCl的耐受性、丙二酸盐利用等生理特性实验以及需氧性、明胶液化、淀粉水解、V-P、糖发酵等生化特性实验［8，11-13］。酵母菌则通过观察菌落特征，染色实验，生理生化实验确定其种属;霉菌主要进行菌落形态和菌体特征观察［14］。

2 结果与分析

2.1 微生物的分离、纯化、产气验证结果

本实验没有分离出酵母菌和霉菌及乳酸菌，但利用营养琼脂培养基分离出了细菌，根据分离结果，选择酱油稀释梯度为10-1的培养皿来分离、纯化细菌，用营养琼脂培养基分离细菌的结果见图1。根据细菌的菌落形态以及用显微镜观察的菌体形态的不同，共分离、纯化出7 株细菌，编号为:k1、k2、k3、k4、k5、k6、k7;同时，对7株细菌进行产气验证实验，结果见表1。

图1 稀释梯度分别为100和10-1Fig.1 Dilutions of 100and 10-1

酱油稀释梯度为100时分离细菌，菌落数太多、又很密集、相互黏连，好多菌落的形态相似，不适合用来分离菌株。稀释梯度为10-1时分离细菌，菌落数有36个，数目适中，且分散，适合分离菌株;其中23个菌落的形态都十分相似，通过显微镜观察菌体形态也极其相似，故判断极有可能是同一种细菌，且为酱油中细菌的优势菌。在10-1稀释度下，根据细菌的菌落形态以及显微镜观察菌体形态的不同，共分离、纯化出 7 株细菌菌株，编号 k1、k2、k3、k4、k5、k6、k7，并于4℃冰箱中用营养琼脂斜面保藏备用。

表1 产气验证实验结果Table 1 Gas production verification results

根据表1可以看出，接种胀袋酱油样品的3支试管在7天后均产气显现已明显，在14天后均有严重的产气现象;空白对照试管在14天内均未出现产气现象，说明了结果是准确可靠的。k1、k3、k4、k5、k6、k7这6株细菌在14天内没有一个试管出现产气现象，k2菌株的1根试管在7天后有微弱的产气，在14 d后3管试管均有明显的产气;由此看出，k2菌株在酱油是产气的。k2菌株产生的气泡体积和胀袋酱油的相比比较小，这可能是由于k2菌株对产气培养的环境有一个适应阶段，而已胀袋酱油微生物种类多，多种微生物间存在着各种相互作用使得适应能力稍微强。但总的来说，k2菌株是导致酱油胀袋的一种微生物，k2菌株在产气培养基中的产气现象如图2所示。

图2 k2菌株的产气实验结果Fig.2 The gas production results of k2strain

2.2 产气微生物的鉴定

由以上可知，产气微生物k2菌株是细菌，根据细菌传统的鉴定方法来鉴定k2菌株。

2.2.1 形态观察

观察k2菌株在营养琼脂培养上的菌落形态、个体形态，并进行革兰氏染色、芽孢染色、运动性观察，染色结果见图3。

图3 k2菌株的革兰氏染色和芽孢染色Fig.3 Gram and spore staining of k2strain

2.2.2 生理特性

耐温、耐酸碱、耐盐特性，丙二酸利用、柠檬酸盐利用实验，结果见表2。

表2 k2菌株生理特性Table 2 Physiological properties of k2strain

2.2.3 生化特性

生化特性:过氧化氢酶实验，甲基红实验，V-P实验，硝酸盐还原实验，明胶液化实验，淀粉水解实验，糖、醇类发酵实验，需氧实验等。对于糖、醇发酵实验，选用液体培养基并在里面加入杜氏小导管观察是否产气，结果见表3。

表3 k2菌株生化特性Table 3 Biochemical properties of k2strain

k2菌株的菌落直径为1～2 mm，不规则圆形，边缘不整齐，中间有凸起，质地表面干燥底层湿润，菌落颜色为灰白色，无光泽，不透明，成菌苔。在液体培养基中有完整菌膜、色暗、褶皱、轻度浑浊或不浑浊。

由图3可以看出，k2菌株为革兰氏阳性菌，有芽孢，菌体呈椭圆形，菌体长度为 3～5μm，直径 ＞0.1μm，芽孢中生，芽孢为圆形，芽孢囊不膨大;不运动。

由生理特性可知，k2菌株具有很强的生存活力。在低温10℃和高温45℃都有生长，但是在10℃及以下长势较弱，k2菌株有很强的耐高温的能力但是耐低温能力差，可以考虑将酱油进行冷藏。实验测得k2菌株在含10%盐分的培养基中长势已经较弱，在14%的盐分中已经不能生长，但酱油的含盐量一般在16%～19%，可能酱油含有的多种成分间的相互作用使得k2菌株也能在此环境下生长，所以在考虑抑菌时要考虑到酱油中的环境，才能确保抑菌效果。

糖、醇发酵实验用的是液体培养基里面有放置小导管，只有发酵葡萄糖的时候出现了微弱的产气现象，其他糖、醇类均未有产气现象。由以上形态观察和生理、生化实验结果可知，k2菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，菌体椭圆，芽孢中生、圆形，发酵葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸，V-P反应阴性，吲哚反应阳性等特性;根据以上特性，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》［12-13］鉴定k2菌株为巨大芽孢杆菌。

本文所研究的酱油样品采用低盐固态发酵工艺，将沉淀过滤后的原油进行调配(山梨酸钾1 g/L)，调配好后经过超高温瞬时灭菌(121～125℃灭菌5 s，出口温度60℃)，灭菌后经水平叶片式过滤机过滤后泵入成品罐澄清，经管道将成品罐中的酱油打入灌装间，罐装到已经消毒过的包装袋内，常温贮存1年;春夏季一般在货架期1个月内出现胀袋现象。酵母菌和霉菌耐热性差一般的杀菌方法就能将其杀死，芽孢杆菌要121℃灭菌25 min才能将其杀死，因此，在此灭菌条件下，芽孢杆菌很容易残留在酱油中，在成品罐内贮存的过程中极有可能二次生长。另外，储罐、管道、灌装间环境等卫生条件控制不好也有可能使产品遭受二次污染。

也有文献指出在酱油中分离出了巨大芽孢杆菌［15］，但是其并未证实该细菌能在酱油中产气。巨大芽孢杆菌在环境中是十分常见的，虽不是致病菌，但酱油中含有多种糖、醇类物质如葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、麦芽三糖、甘油、D-阿拉伯醇、D-甘露醇等［16］，其生化特性显示该菌能发酵多种糖产酸，若是残存在酱油产品中，遇到适宜的条件便生长繁殖产气，在春末、夏季气温较高时就会出现胀袋现象;该菌为酱油生产的有害菌，必须严格控制。成品酱油的普通灭菌方法很难将其杀死，可以通过其他方式来辅助杀菌，有研究指出防腐剂山梨酸钾和乳酸链球菌属在酸性条件下对芽孢杆菌具有较强的抑制作用，比山梨酸钾更广谱、经济的防腐剂尼泊金酯中的尼泊金丙酯钠只需要0.15 g/kg添加量就能很好抑制酱油中细菌的生长［17-18］，防腐剂经高温灭菌后会降低其效能，可以考虑灭菌后添加;另外，对于工厂的生产环境以及设备等进行良好的管理，避免进行二次污染，采用热灌装，出厂前的短时间的热水浴也能有效减缓胀袋［2］。

3 结论

(1)本实验以产自浙江绍兴地区的胀袋酱油为研究材料，利用高糖培养基、营养琼脂培养、MRS培养基、马铃薯蔗糖培养基分离其中的酵母菌、细菌、乳酸菌、霉菌。结果没有分离出酵母菌、霉菌以及乳酸菌;用营养琼脂分离、纯化出编号为k1～k77株细菌。

(2)经产气验证试验证实k2菌株能在酱油中产气，经菌落特征和形态的观察、革兰氏染色和芽孢染色以及系统的生理生化实验，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》鉴定k2菌株为巨大芽孢杆菌。k2菌株为革兰氏阳性细菌，在NaCl含量0～10%、培养基pH4.5～9.5及培养温度10～45℃均能生长，并能发酵葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖等多种糖产酸。

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