1型糖尿病大鼠肾小管间质纤维化的病理改变

郭淑香，孙冬梅，薛瑞凤，李 静，李会学(唐山工人医院分院内科，唐山 06000;河北联合大学附属医院超声科;唐山市妇幼保健院超声科;河北联合大学附属医院超声科;通讯作者，E-mail:sundongmeicui@6.com)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者临床常见而难治的微血管并发症，是导致终末期肾病和DM患者死亡的主要原因［1］。典型的 DN多见于 1型 DM，几乎50%的1型DM患者合并DN，30%的1型DM死于肾功能衰竭［2］。肾小球和肾小管肥大是DN早期的主要病理表现，近来越来越多的研究认为，肾小管间质纤维化是慢性肾脏疾病进行性发展的重要病理基础，它比肾小球硬化更能反映肾脏受损的程度［3］。本实验通过腹腔注射链尿佐菌素(STZ，65 mg/kg)建立SD大鼠1型DM模型，观察其早期肾小管及其间质的病理变化，并探讨其在DN的发生、发展中的意义。

1 材料与方法

1.1 糖尿病大鼠模型的制备及分组

8周龄 SPF级健康雄性 SD大鼠50只，体重180-210 g，平均(199.64 ±11.04)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号:SCXK(京)2009-0004，饲养于河北联合大学屏障环境动物实验室(使用证明编号:MY06DXK07)，饲料为清洁级大小鼠生长颗粒饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司(许可证号:SCXKK(京)2005-0007)。抽签法随机选取32只按剂量65 mg/kg腹腔注射链尿佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma公司)。3 d及 7 d后，断尾法用ACTIVE血糖仪(上海罗氏公司)测血糖，将血糖稳定大于16.7 mmol/L，尿糖持续阳性者定为糖尿病大鼠模型。除去未成模4只及死于急性并发症大鼠10只，余下的随机分为4周、12周、24周组，每组6只;同时选取同周龄大鼠各6只作为正常对照组，正常对照组18只大鼠无死亡。

1.2 标本采集

腹主动脉放血处死动物，立即取肾皮质组织2块放入2.5%戊二醛中，用于透射电镜观察超微结构。其余肾脏组织放入10%中性福尔马林液中固定，用于组织形态学观察(HE、Masson染色)及免疫组织化学染色。

1.3 苏木素-伊红染色(HE染色)

切片常规脱蜡至水，苏木素染色，伊红染色，中性树胶封固。

1.4 胶原染色及计算方法

胶原染色采用Masson三色染色(福州迈新公司)方法。用图像采集系统(Olympus公司)采集图像。应用Motic Med数码医学图像分析系统(深圳麦克奥迪实业有限公司)，测量肾脏间质血管周围胶原面积(perivascular collagen area，PVCA)、肾小管间质病变评分(tubulointerstitial lesion score，TILS)［4］。

计算方法:PVCA=间质小动脉管腔周围胶原面积/该小动脉管腔面积，每组取12张切片，每张切片从肾皮质自外向内，自上向下随机取10-15个视野，取其均值;TILS由3个参数判定(小管扩张和蛋白管型;炎症细胞浸润;间质纤维化)，每个参数按0-3分评定(0为正常，l为轻度受损，2为中度受损，3为重度受损)，每个样本小管间质的评分为0-9分，每张切片随机选择10-15个不含肾小球的视野。以上分析图像均在200倍光镜视野下进行。

1.5 免疫组化染色测定collagaenⅠ、collagaenⅢ的蛋白表达

石蜡切片 collagaenⅠ、collagaenⅢ采用复合消化液酶修复，分别滴加浓度1:100稀释一抗(Rabbit anti-collagaenⅠ、collagaenⅢ、TGF- β1，武汉博士德公司)，放入4℃冰箱过夜。再依次滴加生物素化山羊抗兔IgG，试剂SABC，DAB显色，以胞质内棕黄色细颗粒为阳性信号。每组取12张切片，每张切片随机取10-15个200倍显微镜视野图像，测定平均积分光密度(intergrated optical density，IOD)。

1.6 透射电镜标本制备

肾脏组织脱水，浸透聚合。超薄切片2%醋酸铀染色，枸橼酸铅染色，透射式电子显微镜(日立H-7650)观察摄片。

1.7 统计学分析

全部数据均以Excel建库，通过SPSS13.0软件包进行统计学分析。计数资料进行χ2检验，计量资料数据以±s表示，各组间比较采用随机区组设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

与对照组比较，糖尿病组大鼠多饮、多尿，精神萎靡，活动减少，毛发枯黄、无光泽，明显消瘦，空腹血糖、肾脏质量指数(KWI)明显增加，体重下降，差异有统计学意义(P＜0.05，见表1)，第6周肉眼下观察可见白内障，6个月时均有白内障。正常对照组大鼠精神状态良好，体重增加，毛皮有光泽，动作自如，反应灵敏，未发现有白内障，空腹血糖无明显变化。

表1 各组大鼠空腹血糖、体重、肾重、肾脏质量指数比较(±s)Table 1 Comparison of body weight，fasting blood glucose，and kindney weight at different time between two groups(±s)

表1 各组大鼠空腹血糖、体重、肾重、肾脏质量指数比较(±s)Table 1 Comparison of body weight，fasting blood glucose，and kindney weight at different time between two groups(±s)

肾脏质量指数(KWI)=KW/BW;与同周龄对照组比较，*P＜0.05;与同组别4周比较，△P＜0.05;与同组别12周比较，#P ＜0.05

指标 组别 n 4周 12周 24周FBG/(mmol/L) 对照组65.21 ±0.51 5.03 ±0.32 5.38 ±0.54糖尿病组 6 27.70 ±2.54* 28.01 ±3.02* 25.48 ±3.11*体重/g 对照组 6 293.00±19.11 447.50±12.89△ 526.33±39.29△#糖尿病组 6 233.67 ±26.22* 273.00 ±14.56* 307.33 ±12.70＊△#肾重/g 对照组 6 1.20±0.14 1.90±0.14△ 2.11±0.17△#糖尿病组 6 1.11±0.19 2.04±0.14△ 2.13±0.06△肾脏质量指数*/(mg/g) 对照组 6 4.11 ±0.24 4.26 ±0.21 4.01 ±0.08糖尿病组 6 4.74±0.31* 7.49±0.13＊△ 6.95±0.21＊△#

2.2 光镜下HE染色结果

结果:细胞质、基底膜、胶原纤维、肌纤维呈不同程度红色，细胞核呈紫蓝色。对照组大鼠肾小管上皮细胞大小一致，排列整齐，基底膜完整。糖尿病组大鼠4周时可见肾小管上皮细胞萎缩、脱落、空泡变性、管腔扩张，间质炎性细胞浸润，随病程进展，出现肾小管基底膜不规则增厚，胶原成分增多，小血管硬化(图1，见第79页)。

2.3 Masson染色胶原形态定性分析

结果:胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，细胞核呈蓝褐色。对照组大鼠胶原沉积主要在肾小管周围呈细线样分布。DM组血管周围胶原增密，且较长距离延伸至间质中，肾小管周围的胶原增多，不规则排列连结成片状或团块状，随着病程进展而加重(图2，见第79页)。DM组的PVCA、TILS均显著高于同期对照组(P＜0.05)，随着病程进展，DM组上述指标逐渐增高(P＜0.05，见表2)。

表2 各组大鼠肾脏纤维化指标比较(±s)Table 2 Changes of indicies of renal fibrosis at different time in two groups(±s)

表2 各组大鼠肾脏纤维化指标比较(±s)Table 2 Changes of indicies of renal fibrosis at different time in two groups(±s)

与同周龄对照组比较，*P＜0.05;与同组4周比较，△P＜0.05;与同组12周比较，#P＜0.05

指标 组别 n 4周 12周 24周TILS/分 对照组 6 0±0.10 0±0.10 1±0.30△糖尿病组 6 1.50±0.50* 3±0.80＊△ 4.50±0.90＊△#PVCA/% 对照组 6 0.45±0.07 0.60±0.06△ 0.72±0.07△糖尿病组 6 0.96±0.11* 1.65±0.18＊△ 2.63±0.40＊△#ColⅠ/(×103/μm2) 对照组 6 1.34±0.34 2.17±0.12△ 3.01±0.33△#糖尿病组 6 4.56±0.75* 6.07±0.74＊△ 7.22±0.19＊△#ColⅢ/(×103/μm2) 对照组 6 1.58±0.24 2.95±0.41△ 3.27±0.27△糖尿病组 6 4.68±1.41* 6.60±0.30＊△ 8.25±0.18＊△#

2.4 肾脏组织中collagenⅠ、collagenⅢ的表达

对照组中，Ⅰ型胶原着色于肾间质，呈微弱阳性，DM组Ⅰ型胶原主要在细胞间质呈线状分布，肾小管上皮细胞可见阳性，随病程进展逐渐增高(图3，见第80页);对照组中，Ⅲ型胶原主要在细胞间质和胞质分布，在血管平滑肌细胞亦有表达，呈弱阳性，DM组主要位于肾间质，围绕在萎缩的肾小管周围，或散在于纤维化的肾间质中，或在血管平滑肌细胞及血管腔周围，部分肾小管上皮细胞呈强阳性(图4，见第80页)，随病程进展逐渐增高。与对照组比较，糖尿病各组CollagenⅠ、CollagenⅢ表达均明显增加(P ＜0.05，见表2)。

2.5 超微结构观察

对照组肾小球毛细血管基底膜厚度均一、平滑，肾小管结构清晰。糖尿病组毛细血管基底膜弥漫性增厚，足突融合，近曲小管上皮细胞空泡化，间质内胶原微纤维出现，随时间进展逐渐加重(图5，见第80页)。

图1 造模成功后12周大鼠肾脏HE染色 (×200)Figure 1 HE staining of kidney of normal rats and diabetes rats at week 12 after successful inducing DM models (×200)

图2 造模成功后12周大鼠肾脏Masson三色染色 (胶原呈蓝色，×200)Figure 2 Masson staining of kidney of normal rats and diabetes rats at week 12 after successful inducing DM models (×200)

图3 造模成功后12周collagenⅠ免疫组织化学染色 (棕黄色物质为阳性反应，×200)Figure 3 Immunohistochemistry for collagenⅠin kidney of normal rats and diabetes rats at week 12 after successful inducing DM models (×200)

图4 造模成功后12周collagenⅢ免疫组织化学染色 (棕黄色物质为阳性反应，×200))Figure 4 Immunohistochemistry for collagenⅢin kidney of normal rats and diabetes rats at week 12 after successful inducing DM models(×200)

图5 造模成功后12周大鼠肾脏超微结构 (×8 000)Figure 5 Ultra structure of kidney of normal rats and diabetes rats at week 12 after successful inducing DM models(×8 000)

3 讨论

本研究应用大剂量STZ一次性腹腔注射，破坏大部分胰岛β细胞功能，致胰岛素绝对缺乏，血糖快速升高，并维持高水平，类似人类1型糖尿病发生、发展过程。细胞外基质积聚和基底膜增厚是DN特征性的病理改变。过去认为DN主要病理改变在肾小球，对于肾小管间质病变的研究则重视不够。近年研究显示，糖尿病在肾小球滤过膜发生变化的同时甚至之前，小管间质已发生病变，说明肾小管及间质病变并不完全依赖肾小球病变，其本身也是导致 DN 的独立因素之一［5］。有研究［6］证实，在DN的病理改变中，1/3的病人无肾小球病变，表现为明显的肾小管细胞和肾间质损害;1/3的病人表现为典型的肾小球病变同时存在微量蛋白尿;其他1/3的病人则无肾脏结构变化。安娜等［7］的的临床研究中也发现，在DM患者中反映肾小管功能的酶学指标要比反映肾小球功能的白蛋白更加敏感。朱雪婧等［8］的研究结果证实:DN中肾小管的病变可不依赖于肾小球的病变，有一定程度的独立性。

本研究表明，动物在注射STZ后72 h血糖即明显升高，且在整个实验过程中血糖持续在高水平，大鼠多饮、多食、多尿及消瘦等现象，而且，在光镜和电镜下可见DM大鼠肾脏在病程4周时即出现了肾小管扩张和肾小管上皮细胞上皮细胞萎缩、脱落、空泡化，并随着病程进展受损肾小管数量增多，肾小管基底膜增厚及小管间质纤维化。这意味着在DM早期肾小管本身已经发生了病变，而不是继发于肾小球损害。

肾组织纤维化是DN的病理性特征改变，贯穿了整个DN病程并最终演变成终末期肾病。肾小管间质纤维化(renal tubulointerstitial fibrosis，TIF)是糖尿病肾病发展至终末期肾病必经的病理过程，近期研究发现，肾小球疾病的长期预后及肾功能改变与肾小管间质损伤程度密切相关［9，10］，其中肾小管损伤是TIF的主要起动因素［11］。但是，对于肾小管间质的发病机制研究不是十分清楚。目前多数学者已达成共识，各种不同的致损因子均通过调节3个基本的环节发挥作用:TEC(肾小管上皮细胞)增生与凋亡;ECM(细胞外基质)沉积与降解;TEC表型转化。其中，以细胞外基质(ECM)积聚为主要病理基础，ECM的主要成分是胶原纤维(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原)，Masson染色是常用的胶原纤维(主要为Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白)染色方法，本研究应用肾脏间质血管周围胶原面积(PVCA)、肾小管间质病变评分(TIDS)来评价肾小管间质纤维化情况。结果 显示:由DM第4周开始，HE染色已可见明显的病理变化，Masson定性分析显示自第4周起，DM组胶原含量明显高于对照组，这是DN的直接证据。超微结构亦可见DM组随病程肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚，足突融合，间质内大量胶原微纤维成束出现。DM组3个月和6个月组胶原含量均显著高于对照组，表明早期即出现胶原的增生，且主要是Ⅲ型胶原在细胞间质的广泛性、弥漫性表达并进行性增多，使DM大鼠肾脏僵硬度增加。因此，本研究提示在早期糖尿病中就出现肾小管间质的纤维化改变，且随病程而加重。

综上所述，DN的肾脏损害不仅局限于肾小球，而且常伴有肾小管间质的损害，并且部分患者肾小管受损还可能先于肾小球受损。通过对DM模型的病理分析，发现肾小管间质病变在DN的发生、发展中具有重要意义，其有助于早期判断DN肾损害程度并改善其预后。

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