磁共振血管造影在磷酸二酯酶4D基因多态性与缺血性脑卒中相关性研究中的应用

汪瑞霞++杨佳++张哲林

[摘要] 目的 探讨磷酸二酯酶4D（PDE4D）基因多态性与缺血性脑卒中（IS）患者磁共振血管造影（MRA）结果的相关性。 方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测245例IS患者和208例正常对照组PDE 4D基因SNP83及SNP87酶切多态性。同时开展MRA检查结果与PDE 4D基因SNP83及SNP87多态性相关性分析。 结果 245例IS患者中，77.78%患者MRA结果异常，其中，颅外血管（ECMRA）异常占53.37%，颅内（ICMRA）异常占65.80%，两者兼有占41.97%。脑卒中患者的PDE 4D基因SNP 83的CC基因型频率较正常对照组高（OR为3.57，95%CI 1.39～6.52，P < 0.01）；与ICMRA结果正常的患者相比较，ICMRA结果异常的脑卒中患者的PDE 4D基因SNP 87的TT基因型频率增高（OR为0.57，95%CI 0.01～0.43，P = 0.01）。PDE 4D基因SNP 83的基因型及等位基因频率与MRA异常结果无显著相关（P > 0.05）。 结论 PDE 4D基因SNP 87多态性与MRA结果异常相关。PDE 4D基因SNP 83与IS相关，与MRA结果异常无显著性相关。

[关键词] 磷酸二酯酶 4D基因多态性；缺血性脑卒中；磁共振血管造影

[中图分类号] R743.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）11（a）-0018-05

Phosphodiesterase 4D gene polymorphism correlation with MRA findings in patients with ischemic stroke

WANG Ruixia YANG Jia ZHANG Zhelin

Department of Neumlogy， the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010050， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between phosphodiesterase 4D （PDE 4D） gene polymorphism and MRA findings in patients with ischemic stroke （IS）. Methods Three polymorphisms SNP 83 and SNP 87 in PDE 4D gene were analyzed in 245 patients of IS and 208 controls using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method in a case-control study. Meantime to carry out the polymorphisms SNP 83 and SNP 87 in PDE 4D gene correlation with MRA findings in patients with ischemic stroke. Results Among the 245 patients， MRA was abnormal in 77.78% patients； extracranial MRA （ECMRA） in 55.37%， intracranial MRA （ICMRA） in 65.80% and both were abnormal in 41.97% patients. The frequency of CC genotype of PDE4D83 was significantly higher in the patients with ischemic stroke compared to controls （OR = 3.57， 95%CI 1.39-6.52， P < 0.01）. The frequency of TT genotype of PDE4D87 was significantly higher in ICMRA abnormalities compared to normal ICMRA （OR = 0.57， 95%CI 0.01-0.43， P = 0.01）. The genotype and allele frequency of PDE4D83 was not significantly related to MRA abnormalities （P > 0.05）. Conclusion The PDE 4D gene SNP 87 polymorphism is associated with MRA abnormalities， but SNP 83 is associated with IS and not significantly related to MRA abnormalities.

[Key words] Phosphodiesterase 4D gene polymorphism； Ischemic stroke； Magnetic resonance angiography

缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）是由多种遗传与环境因素共同作用导致的一类极其复杂的神经系统疾病，其主要是由颅外动脉血管（颈动脉及脊椎基底动脉）或者颅内动脉血管动脉粥样硬化造成的[1-2]。研究表明，无症状的动脉粥样硬化的斑块、微栓子脱落可反复出现短暂性脑缺血发作症状，一旦斑块破裂、出血，就可突然发生脑卒中。同时在高血压症状的影响下，血脂较高者颅内小动脉也易发生粥样硬化，斑块形成，血管腔狭窄。当血压升高或降低时易诱发血栓形成导致脑梗死[3-5]。目前常常采用磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）对颈动脉粥样硬化引发的脑卒中进行无创性检查[6]。其可同时观察两侧颈部和颅内动脉，是临床医师选择治疗方案的重要依据。

磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）是一类催化水解cAMP和cGMP，使其转变为失去活性的单核苷酸的关键酶，是cAMP和cGMP水解的唯一途径[7]。PDE的活性是调控细胞内信号转导的强度和持续时间的重要因素。至今已鉴定出PDE有11个家族，共30余种。PDE4D是PDE中的大家族，是保持cAMP稳态的重要调节者，是炎症和免疫细胞的主要PDE同工酶，是PDE家族中最大的一群，其有四个亚型（PDE4A、4B、4C、4D），各种亚型又有多种次亚型[8]。PDE4D在体内广泛表达，主要分布于各种炎症细胞内，包括肥大细胞、巨噬细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞和上皮细胞等。PDE4D为cAMP特异性PDE，其作用为水解细胞内cAMP水平，而后者是一种有多种生物学作用的分子，其作用之一是影响血管细胞的增殖和移行。因此，PDE4D可能通过其水平和活性的变化影响细胞内cAMP水平，进而可能参与动脉粥样硬化进程[9]。为此，本研究选取Gretarsdottir等[10]于2003年首次证实PDE4D基因单核苷酸多态性与IS相关的研究中关联显著的2个位点，即SNP 83、SNP 87展开研究，探讨PDE4D基因多态性与IS患者MRA结果的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例组：选取2010年10月～2012年11月间内蒙古医科大学附属医院（以下简称“我院”）神经内科住院的经MRI检查诊断为IS患者245例，男135例，女110例；年龄40～87岁，平均（62.88±8.75）岁。进一步对IS患者颅外（颈动脉及脊椎基底动脉）及颅内动脉血管开展MRA检查，将其分为MRA结果异常与MRA结果正常两组。患者间均无亲属关系。无脑卒中病史的对照组：选取同时期我院体检中心健康体检者，共计208例，男118例，女90例；年龄43～85岁，平均（61.21±7.56）岁。均行神经查体、头颅MRI/A及血管超声检查，排除既往卒中、TIA、血管狭窄等症状。患者间均无亲属关系。

入选标准：病例组患者经MRI/A检查，证实颅内、外动脉存在狭窄≥50%或闭塞；存在与病变侧血管供应区明显相关的临床症状与体征特点；符合国际疾病分类第9版（ICD 9）的IS诊断标准，均属于急性卒中治疗试验（TOAST）中的动脉血管粥样硬化引起的IS。

排除标准：存在与脑卒中相关的心源性栓塞及主动脉夹层、大动脉炎、心肌梗死、甲状腺功能紊乱、脑静脉窦血栓症等患者。

脑卒中的临床风险因素：包括高血压[收缩压 ≥140 mm Hg及舒张压≥90 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），高血病史及药物治疗情况]、糖尿病（空腹血糖≥106 mg/dL，餐后2 h血糖≥200 mg/dL及药物治疗情况）、血脂异常情况（血脂指标、冠状动脉疾病）、脑卒中病史、吸烟及饮酒情况。

所有研究对象均于研究课题开始前，签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集及MRA检查 抽取受试对象空腹血液标本，全自动生化分析仪进行血常规、血糖、血脂、肝肾功能等项目检测，并且详细询问病史及临床相关危险因素。MRA检查内容如下：受试对象1周之内采用1.5 T磁共振扫描器对颅内及颅外动脉血管造影检查。扫描序列采用较厚3D层块容积（颅内动脉3层块，颅外6层块），26 ms脉冲重复时间（TR）、6.9 ms回波时间（TE）和20°反转角（FA）。由课题组外的资深神经系统放射专家，依据MRA最大信号强度投影计算血管狭窄程度，若血管狭窄程度﹤50%，即认为血管病变程度没有临床意义；若血管狭窄程度≥50%即认为MRA结果异常，临床上有重要意义；若血管狭窄程度为50%～<80%，认为中等程度狭窄；若血管狭窄程度为80%～<90%，认为严重狭窄；若血管狭窄程度为90%～100%，认为完全闭塞。

1.2.2 基因多态性分析 基因组DNA采用血液基因组柱式小量提取试剂盒（0.1～1.0 mL）（北京康为世纪生物科技有限公司）提取。SNP83位点序列上游引物：5′-TTGTTTCTAGTTAGCCTTG-3′；下游引物：5′-ATTTGGCCTTGCAATATAC-3′；SNP87位点序列上游引物：5′-AAGATGAGGAAGAATAATCC-3′；下游引物：5′-ATGAAGACACCTGAAAGATC-3′。PCR扩增体系25 μL（Mastermix 12.5 μL；模板DNA 250 ng；上下游引物各1.0 μL，不足体积用无酶水补足）。PCR扩增条件：95℃5 min；95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，41个循环；72℃延伸5 min。取5 μL扩增产物进行酶切（酶切体系15 μL）。内切酶分别为TaiⅠ（New England Biolabs）及SSP1（New England Biolabs）限制性内切酶。酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，于凝腔图像分析系统下分析基因型。

1.2.3 酶切结果判定 SNP83缺乏相应酶切位点为T/T型纯合子（359 bp，1条带），存在相应酶切位点为C/C型纯合子（264 bp、95 bp，2条带），若为C/T杂合子型（359 bp、264 bp、95 bp，3条带）；SNP87缺乏相应酶切位点为T/T型纯合子（264 bp、222 bp，2条带），存在相应酶切位点为C/C型纯合子（486 bp，1条带），若为C/T杂合子型（486 bp、264 bp、222 bp，3条带）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.00统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；等位基因计数采用直接计数法，并计算基因型频率，不同基因型及等位基因分布频率比较采用χ2检验，多因素分析采用Logistic回归。以P < 0.05为差异有统计学意义。