正交试验法优选五味温通除痹胶囊水提工艺

2014-12-13张玉婷高家荣韩燕全

安徽医药 2014年10期

张玉婷，高家荣，刘健，韩燕全，姜辉，吴健，刘娟，罗欢

(1.安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室;2.安徽中医药大学，安徽合肥 230031)

五味温通除痹胶囊是安徽中医药大学第一附属医院风湿科刘健教授根据多年临床经验研制的验方，处方由淫羊藿、茯苓、黄芩、片姜黄、桂枝等5味中药组成;具有温阳通脉，散寒止痛的功效，主要治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、寒湿痹阻型所致的关节疼痛、肿胀，畏寒怕冷等病症［1－2］。为优化其制备工艺，本试验采用 L9(34)正交设计试验方法，通过对水提工艺影响较大的因素如提取次数、提取时间、加水量等因素进行考察。由于淫羊藿是方中的君药，故以淫羊藿苷提取率、浸膏得率为评价指标进行综合评定，优选出该制剂的最佳水提工艺，为优化其制备工艺提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，包括四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器以及Empower2数据处理工作站;BP211D电子天平(德国塞多利斯公司);PTHW型调温电热套(巩义市予华仪器有限责任公司);HH－S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司);真空干燥箱(上海博远实业有限公司);KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药淫羊藿苷对照品(含量测定用，批号110737－200312)，购自中国药品生物制品检定所;处方药材饮片均由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供，经李立华主任中药师鉴定均符合《中国药典》(2010版)一部规定;甲醇、乙腈均为色谱纯(美国Tedia公司);水为屈臣氏蒸馏水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计根据本处方中君药的主要有效成分的化学性质及预实验结果，采用L9(34)正交表安排试验方案，考察主要因素加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)，以淫羊藿苷提取率、浸膏得率为评价指标进行综合评分(权重系数分别为0.6、0.4)，优选最佳水提工艺。正交试验因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表

按处方配比称取各药材9份，根据正交试验设计的条件进行加热回流，合并提取液、滤过，减压浓缩，备用。

2.2 淫羊藿苷含量的测定

2.2.1 色谱条件色谱柱:Acquity BEH C18柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm);流动相:乙腈－水(27∶73);柱温:22℃;流速:0.2 mL·min－1;检测波长:270 nm;进样量:1.0 μL。见图1。

2.2.2 对照品溶液制备精密称取淫羊藿苷对照品适量，精密加入甲醇制成含淫羊藿苷0.16 g·L－1的对照品溶液母液，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备将干浸膏研成粉末，过60目筛，称定1 g置锥形瓶中，加入稀乙醇20 mL，称定重量，超声处理(功率100 W，频率40 Hz)1 h，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.2.4 阴性对照品溶液及原药材溶液的制备按处方比例，取除淫羊藿外的其他药材，按照制剂工艺制成干浸膏，再按“2.2.3”项下方法制备阴性对照品溶液。另取淫羊藿粉末0.5 g，按“2.2.3”项下配制原药材溶液，备用。

图1 UPLC色谱图

2.2.5 系统适用性试验将淫羊藿苷对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液按“2.2.1”色谱条件进样分析，由图1可知，淫羊藿苷保留时间约在5.40 min，其色谱峰与其相邻峰达到完全基线分离，对照品溶液与供试品溶液在相同位置有对应的色谱峰，阴性对照溶液在相应位置无干扰。

2.2.6 线性关系考察分别将母液用甲醇稀释成0.016、0.032、0.064、0.096、0.128、0.160 g·L－1浓度的对照品溶液，按上述色谱条件测定，以峰面积(Y)为纵坐标，以浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=30 108 528.08X －94 023.65，r=0.999 9。结果表明，淫羊藿苷在 0.016 ～0.160 μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验取淫羊藿苷对照品溶液重复进样6次，按上述色谱条件测定峰面积，RSD为1.82%(n=6)，结果表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验取正交试验第5组供试品溶液，分别在第0、2、4、8、12、24 h 测定峰面积，RSD 值为4.09%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.2.9 重复性试验取正交试验第5组样品浸膏，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，RSD值为1.89%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验取6份已知含量的样品，加入淫羊藿苷对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制成溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

2.3 浸膏得率的测定将“2.1”项下9份稠浸膏置干燥箱中，70℃减压干燥至恒重，移至干燥器中冷却30 min，迅速称重。计算浸膏得率，浸膏得率(%)=浸膏重量/原药材的重量×100%。

2.4 正交试验结果及分析以淫羊藿苷提取率及浸膏得率为指标，考察水提工艺，正交试验安排及结果见表3，对实验结果进行方差分析，结果见表4。

表3 正交试验安排L9(34)及结果考察

表4 方差分析结果

2.5 最佳工艺确定以以淫羊藿苷提取率和浸膏得率为指标，综合评分结果显示，由各因素水平直观分析的K值高低可以得出影响水提效果的因素主次为C＞A＞B，最优水平组合为A3B3C3。方差分析结果表明，因素C(提取次数)对试验结果影响有显著性意义(P＜0.05)，而因素 A(加水量)、B(提取时间)对试验结果影响无显著性意义。由于在实际生产中，从节约时间及能源，提高生产效率，以及生产的可行性等角度综合考虑，制定最佳提取工艺为加10倍水，提取3次，每次1.0 h。

2.6 验证试验按处方配比，取与正交试验同批次的药材共3份，分别加10倍水，提取3次，每次1.0 h。平行测定3次，经计算淫羊藿苷的提取率为(74.59 ±2.32)%，浸膏得率为(15.87 ±0.27)%。由验证试验结果表明优选的条件稳定、可靠、有效成分提取率较高。

3 讨论

淫羊藿作为方中的君药，其主要活性成分为淫羊藿苷，可溶于水，甲醇，乙醇等溶剂，故可以用水提法，乙醇回流法等方法提取［3－11］。本试验为了降低成本，便于制剂大批量生产，故采用具有应用广泛、装置简单的传统水提法。

查阅相关文献，大都采用HPLC法测含量［12－14］，本实验首次建立了UPLC法测定淫羊藿苷提取率的方法，采用乙腈－水(27∶73)为流动相，较药典［15］的梯度洗脱更节约溶剂，此方法所用时间为16 min，较药典的55 min，大大的节省了测定时间。在保持较高的准确度和精密度的同时，提高了分离效率，减少了溶剂的损耗，缩短了测定时间，为该制剂的质量控制提供了一种更为快速准确的测定方法。

本试验采用正交试验，通过综合评分法，优选出的提取工艺更具有科学性和合理性，对提取工艺的研究有着积极的指导意义，也是进行工艺筛选评价的一个可行模式。该水提工艺设计合理，可为五味温通除痹胶囊的研制提供理论依据和试验基础。

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