以棋盘法测定汉防己甲素联合伏立康唑的体外抗烟曲霉活性

刁文琦 吴锐 宋延君 李水秀 吕霞琳 王露霞 刘维达 张宏

以棋盘法测定汉防己甲素联合伏立康唑的体外抗烟曲霉活性

刁文琦 吴锐 宋延君 李水秀 吕霞琳 王露霞 刘维达 张宏

目的探讨汉防己甲素对伏立康唑抗烟曲霉的体外增效活性。方法参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的M38-A2方案，采用棋盘式微量液基稀释法测定汉防己甲素联合伏立康唑对21株烟曲霉临床株的抗真菌活性，以吸光度A值测定法判读最低抑菌浓度，并以FICI法评价联合用药的效果，同时以其中的CMCC(F)A.1a株为代表，用等效线图解法验证结果。结果汉防己甲素与伏立康唑单独作用于上述烟曲霉临床株的最低抑菌浓度分别为512 μg/ml和0.125～2 μg/ml，联合用药时的最低抑菌浓度值分别降至 8 ～ 128 μg/ml和 0.03 ～ 0.5 μg/ml，且终点清晰，“拖尾现象”消失，FICI值为 0.13 ～ 0.63，有 16 株菌表现为协同作用，其余菌株表现为无关作用。CMCC株相应的MIC值等效曲线是凹形，也表明具有协同作用。结论汉防己甲素对伏立康唑抗烟曲霉有体外增效活性。

粉防己碱；伏立康唑；烟曲霉；增效作用；棋盘法

近年来，由于血液系统肿瘤、艾滋病及器官移植患者的增加，深部真菌病的发病率及病死率也随之升高[1]。其中由烟曲霉感染引起的侵袭性曲霉病的病死率可高达80%[2]。尽管两性霉素B、三唑类及棘白菌素类等药物使曲霉病患者生存率得到显著改善，但随着在临床上的广泛应用，其耐药率逐渐增加，致使侵袭性曲霉病的治疗已成为临床上的棘手问题[1]。有文献报道，抗真菌药物的联合应用可能对于一些侵袭性曲霉病的治疗具有协同作用[2]。我们先前的研究发现，天然药用植物汉防己根的双苄基异喹啉类化合物汉防己甲素(tetrandrine，TET)对氟康唑或酮康唑抗白念珠菌、联苯苄唑或益康唑抗毛癣菌属活性有增效作用，其主要机制可能与抑制药物外排泵相关基因的表达有关[3-7]。为研究TET对唑类药物抗烟曲霉是否也具有增效活性，本实验采用棋盘式微量液基稀释法(简称棋盘法)测定TET与伏立康唑(voriconazole，VRC)联合作用于21株烟曲霉临床株的体外抗真菌活性，以吸光度A值测定法判读最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，并以分数抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI) 法及其等效线图解法评价并验证联合用药的效果。

材料与方法

一、材料

1.菌株来源：21株烟曲霉临床株[AF5、AF7、AF8、AF9、AF10、AF13、AF18、AF19、AF20、AF21、AF23、AF24、AF26、AF27、AF30、AF31、AF38、AF46、0193、CBS542.75、CMCC(F)A.1a]，前 18 株由广州军区广州总医院检验科王露霞副主任技师惠赠，后3株由中国医学科学院皮肤病研究所刘维达教授惠赠。质控菌株选用美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的近平滑念珠菌ATCC 22019株。

2.培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，广东环凯微生物科技有限公司)，RPMI1640培养基(美国Gibco公司，pH 7.0)。

3.主要试剂：VRC(山东华禧药业有限公司，批号20110510，纯度 ＞98.5%)，TET(陕西慧科植物有限公司，批号20041226，纯度98%)，二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)。

4.主要仪器：酶标仪(680型，美国Bio-Rad公司)，96孔板(美国Costar公司)。

二、方法

1.菌株的活化与菌悬液的配制：分别将受试菌株于PDA中在30℃下活化5～7 d，使用过滤器滤除菌丝后，稀释于RPMI1640液体培养基中，经血细胞计数板计数孢子以调整菌液浓度，终浓度为(0.4～5.0)×104CFU/ml。

2.药液配制：用DMSO将VRC溶解成5120 μg/ml的药物储备液；用灭菌双蒸水将TET溶解成10 240 μg/ml的药物储备液，并用0.1 mol/L HCl将其调整成合适pH，使其充分溶解。各药物储备液分别过滤分装后，在-20℃下贮存备用。

3.测定TET及VRC单独对烟曲霉的MIC：参照CLSI M38-A2方案[8]，将VRC、TET储备液分别用RPMI1640稀释为2倍工作浓度(VRC 0.007 5～8 μg/ml，TET 16 ～ 1 024 μg/ml)。 取其 100 μl经倍比稀释后依次加入96孔板的第2～11列；除第12列外，其余各孔均加入 100 μl菌悬液，不足 200 μl液体的孔用RPMI1640补足。此时第1列为生长对照，第12列为空白对照。各孔中DMSO含量均不高于1%，对菌株生长无影响。将制备好的96孔板在37℃恒温培养箱中培养48 h，以吸光度A值测定法判读结果，确定MIC值。实验重复3次，结果取中位数。

吸光度A值测定法：用酶标仪读取各孔波长在405 nm处的A值。真菌生长百分数和真菌生长抑制百分数分别按以下公式计算：真菌生长百分率 =(各孔A值-空白对照孔A值)/(生长对照孔A值-空白对照孔A值)×100%；真菌生长抑制百分率=1-真菌生长百分率。

取真菌生长抑制率在90%以上的最低药物浓度为MIC值[9]。

4.测定TET与VRC联合抗烟曲霉的活性：参照CLSI M38-A2方案[8]，将VRC、TET储备液分别用RPMI1640稀释为4倍工作浓度(工作浓度范围分别为：VRC 0.0075 ～ 8 μg/ml，TET 8 ～ 512 μg/ml)。按从低浓度到高浓度的顺序，取50 μl倍比稀释的VRC药液，依次加入96孔板的第2～12列；按从高浓度到低浓度的顺序，取50 μl倍比稀释的TET药液，依次加入96孔板的第A～G行。除A12孔，向其他孔各加入100 μl菌悬液，并用RPMI1640补足少于200 μl液体的孔。其中，H1孔为生长对照孔(不含药液)，A12孔为空白对照孔(不含菌悬液)。将配制好的96孔板在37℃恒温培养箱中培养48 h，以吸光度A值测定法判读结果。实验重复3次，结果取中位数。

5.药物联合作用效果的评价方法：结果评价采用CLSI建议的判定方法：FICI≤0.5为协同作用，且FICI越小，其协同作用越强；FICI＞4为拮抗作用；0.5＜FICI≤ 4为无关作用[10]。

等效线图解法：通过棋盘法，以CMCC株为代表，将其MIC值按照等效线图解法绘制，根据等效曲线的形状可以判断协同(凹形)、拮抗(凸形)、无关(直线)[11]。

结 果

1.质控标准：实验中每次所测得的质控菌株ATCC 22019株对VRC的MIC值为0.06或0.125 μg/ml，均在CLSI M38-A2规定的参考范围内，且生长对照孔生长良好，符合CLSI的要求。

2.TET与VRC单独或联合用药的MIC：见表1，判断烟曲霉对伏立康唑的敏感性是按照CLSI推荐的ECVs标准，以VRC的MIC≤1 μg/ml为敏感，2 μg/ml为剂量依赖性敏感， ＞ 2 μg/ml为耐药[12]。 本实验采用的21株烟曲霉临床株中，除CMCC株为VRC剂量依赖性敏感株外，其余均为VRC敏感株。TET对上述烟曲霉临床株的MIC值均为512 μg/ml，TET＜8 μg/ml时无抗菌作用，且无菌株差异性。

TET与 VRC联合作用时，TET的 MIC值由512 μg/ml降至 8 ～ 256 μg/ml，VRC 的 MIC 值由0.125 ～ 2 μg/ml降至 0.03 ～ 0.5 μg/ml， 且终点清晰，“拖尾现象”消失。说明TET可增强VRC抗烟曲霉的体外抗真菌活性。

表1 汉防己甲素与伏立康唑体外联合作用于21株烟曲霉的最低抑菌浓度值及结果评价

图1 汉防己甲素与伏立康唑联合作用于CMCC株的真菌生长分数图 灰色区域：生长分数超过10%的孔；黑色粗体部分：取分数抑菌浓度的位置；下划线标注的黑色粗体：取分数抑菌浓度指数的位置

图2 汉防己甲素与伏立康唑体外联合作用于CMCC株的最低抑菌浓度值等效曲线

3.FICI法及其等效线图解法对实验结果的评价：见表1，TET与VRC联合作用时，有76.2%的菌株表现为协同作用，23.8%的菌株表现为无关作用，FICI值为0.13～0.63，平均值为0.44＜0.5，说明TET与VRC联合作用时主要表现为协同作用。

图1反映了TET与VRC联合作用于CMCC株时的真菌生长分数情况，通过计算黑色粗体部分的ΣFIC值，可知ΣFICmax为0.56＜4，即FICI值为ΣFICmin=0.16。图2是其相应的等效曲线，凹形表明两者具有协同作用。

讨 论

VRC是氟康唑的衍生物，为第二代三唑类抗真菌药物，抗菌谱广，生物利用度高，是治疗侵袭性曲霉病的一线药物。然而，随着VRC的广泛应用，烟曲霉对其耐药现象日益严重，给曲霉病的临床治疗带来很大困难[1]。有研究表明，烟曲霉对VRC的耐药机制可能与药物外排过度有关[13]。

TET源于天然药用植物防己，作用温和、来源广泛、价格低廉，已用于抗高血压、抗心绞痛、抗肿瘤等治疗领域。我们前期研究也发现，TET对氟康唑或酮康唑抗白念珠菌、联苯苄唑或益康唑抗毛癣菌属活性有增效作用，作用机制可能与抑制药物外排 泵 基 因 MDR1、FLU1、CDR1、CDR2的表达有关[6]。鉴于此，我们参照CLSI推荐的M38-A2方案，采用棋盘法、FICI法及其等效线图解法对本实验进行抗真菌活性的测定和评价，以探讨TET在体外对VRC抗烟曲霉是否有增效活性。

目前，本实验采用的棋盘法、FICI法及其等效线图解法已被广泛应用于抗感染药物体外联合用药的测评，具有操作简便可行、重复性好等优点。Loewe additivity(LA)理论是评价药物联合作用效果最为常用的数据处理方法，其核心思想是任何一种药物本身无相互作用，即当观察到的药效比假设无相互作用的药效高或低时，就分别称为协同作用或拮抗作用。本实验所采用的FICI法就是以LA理论为基础发展出的非参数法模型。其公式为ΣFIC=FICA+FICB=CAcomb/MICAalone+CBcomb/MICBalone，式中的MICAalone和MICBalone分别为药物A和B单用时的MIC，CAcomb和CBcomb为两种药物联用时达到与单独用药相同药效时各自的浓度。对于同一块96孔板来说，计算数据获得一系列ΣFIC值，当ΣFICmax(最大ΣFIC值)小于4时，FICI定义为ΣFICmin(最小ΣFIC值)；否则FICI将定义为ΣFICmax。等效线图解法是在FICI法基础上用来验证联合作用效果的方法。若两药联合后的MIC值降到单药MIC的1/4即可认为两药有协同作用，这意味联合用药的ΣFIC≤0.5。对结果的判读采用吸光度A值测定法，较肉眼观察法具有客观、定量、简便等优点。

按照CLSI推荐的ECV标准，本实验选用的烟曲霉临床株中有20株为VRC敏感株，1株为VRC剂量依赖性敏感株。在TET与VRC联合用药时，VRC的MIC较单独应用时降低了1～4个梯度，且TET自身的MIC值也较单独应用时降低了1～6个梯度。FICI(TET+VRC)平均值为0.44，＜0.5，表明TET对VRC抗烟曲霉有体外增效活性。我们还选用了剂量依赖性敏感株CMCC株绘制了相应的MIC值等效曲线，凹形也说明TET与VRC联合用药具有协同作用。

尽管绝大多数菌株为VRC敏感株，但因敏感性不同，其 FICI值也不同。 其中，FICI(MIC≥1μg/ml)平均值为 0.36，FICI(MIC＜1μg/ml)平均值为 0.49，即 TET 与 VRC联合作用时对敏感性较低的菌株增效作用较强，而对敏感性较高的菌株增效作用较弱，说明TET在体外增强VRC抗烟曲霉的活性可能与逆转其耐药性有关。本实验结果表明汉防己甲素对伏立康唑抗烟曲霉有体外增效活性，为临床以汉防己甲素作为伏立康唑增效剂治疗烟曲霉病提供了依据。

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2013-04-26)

(本文编辑：吴晓初)

In vitroevaluation of the activity of tetrandrine combined with voriconazole againstAspergillus fumigatusby a checkerboard method

Diao Wenqi*，Wu Rui，Song Yanjun，Li Shuixiu，Lyu Xialin，Wang Luxia，Liu Weida，Zhang Hong.*Department of Dermatology，First Affiliated Hospital；Institute of Mycology，Jinan University，Guangzhou 510632，China

Zhang Hong，Email:tzhangh@jnu.edu.cn

ObjectiveTo evaluate the synergistic effect of tetrandrine(TET)with voriconazole(VRC)againstAspergillus fumigatus.MethodsA checkerboard microdilution method was used to estimate the activity of TET combined with VRC against 21 clinical isolates ofAspergillus fumigatusaccording to the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)M38-A2 document.The minimal inhibitory concentration(MIC)was determined using spectrophotometry.Fractional inhibitory concentration index(FICI)was calculated to evaluate the interaction between the two antifungal agents.The isobologram method was used to verify the test results with theAspergillus fumigatusstrain CMCC(F)A.1a as the representative strain.ResultsThe MICs of TET and VRC against these clinical isolates were 512 μg/ml and 0.125-2 μg/ml，respectively when used alone，8-128 μg/ml and 0.03-0.5 μg/ml respectively with clear end points accompanied by disappearance of the so-called"trailing"phenomenon when used in combination.The FICI of these agents ranged from 0.13 to 0.63.The interaction between TET and VRC was synergistic in 16 clinical isolates，but indifferent in the remaining strains.Moreover，the isobologram analysis revealed concaves with a shape characteristic of synergy.ConclusionTET exerts a synergistic effect with VRC againstAspergillus fumigatus.

Tetrandrine；Voriconazoles；Aspergillusfumigates；Synergisticeffect；Checkerboard microdilution method

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.007

国家自然科学基金(81171542)；广东省科技计划项目(2009B030801015)；广州市科技支撑项目(2010J-E011)；中央高校基本科研业务费专项资金(21611509)

510632广州，暨南大学附属第一医院皮肤科、暨南大学真菌病研究所(刁文琦、吴锐、宋延君、李水秀、吕霞琳、张宏)；广州军区广州总医院(王露霞)；中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所(刘维达)

张宏，Email：tzhangh@jnu.edu.cn