转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α在银屑病皮损中的表达及意义

贾琨 张晓峰 董宇昊 张岩 马伟元

转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α在银屑病皮损中的表达及意义

贾琨 张晓峰 董宇昊 张岩 马伟元

目的探讨转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBP-α)在寻常性银屑病皮损中的表达及与角质形成细胞异常增殖及皮损严重程度间的相关性。方法用免疫组化二步法及Western印迹检测30例寻常性银屑病患者皮损和30例健康对照皮肤的表皮中C/EBP-α。免疫组化法检测Ki-67的表达,并根据Ki-67阳性表达数量计算增殖指数,Pearson相关分析法分析寻常性银屑病皮损中C/EBP-α的表达水平与角质形成细胞Ki-67增殖指数及银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI评分)间的相关性。结果C/EBP-α主要在角质形成细胞胞质中表达,寻常性银屑病皮损中C/EBP-α的表达较健康对照皮肤明显下调(t=7.82,P＜0.05)。Ki-67主要在角质形成细胞胞核中表达,寻常性银屑病皮损中角质形成细胞的增殖指数明显高于健康对照皮肤(t=4.54,P＜0.05)。经Pearson相关分析,寻常性银屑病皮损中C/EBP-α表达水平与增殖指数呈负相关,与PASI评分呈负相关。Western印迹结果亦显示,C/EBP-α在银屑病皮损处的表达量显著下调。结论C/EBP-α在寻常性银屑病皮损中表达下调,可能参与了寻常性银屑病的发病过程。

银屑病;CCAAT增强子结合蛋白α;增殖指数

目前认为,银屑病是遗传因素与环境因素等相互作用的多基因病,通过免疫介导的共同通路最后引起角质形成细胞发生增殖。角质形成细胞过度增殖造成的表皮增生肥厚与角化不全是其典型病理特征。转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBP-α)是一种含亮氨酸拉链结构域的基本转录因子,在机体多种已分化组织中高度表达[1]。研究证实,C/EBP-α在表皮各层细胞中均有表达,参与表皮细胞增殖和分化的调控过程,且与多种皮肤肿瘤的发病密切相关[2]。我们用免疫组化技术检测C/EBP-α在寻常性银屑病皮损中表达,分析其与增殖指数和银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)间的相关性,探讨C/EBP-α在寻常性银屑病发病机制中的作用。

一、资料与方法

1.临床资料:30份蜡块标本均来源于2010—2011年于山东大学齐鲁医院就诊并确诊为寻常性银屑病进行期患者。其中男16例,女14例,年龄13～45岁,平均年龄27.8岁,病程10 d至9年。30例健康人均无皮肤病,由山东大学齐鲁医院皮肤科、医疗美容科留取皮肤标本,制成蜡块后保存,其中男16例,女14例,年龄12～46岁,平均年龄31.8岁,两组在性别、年龄、取材部位上相匹配,差异无统计学意义(P＞0.05)。PASI按照文献[3]方法计算。

2.主要试剂:浓缩型兔抗人C/EBP-α多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司),即用型鼠抗人Ki-67单克隆抗体、二步法免疫组化试剂盒、DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。RIPA裂解液(强)、PMSF(碧云天生物技术研究所)、10%SDS-PAGE预制胶、ECL试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白(美国Earthox公司)。其他试剂均由山东大学齐鲁医院皮肤科实验室提供。

3.免疫组化方法:所有标本均由组织活检获得,4%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,切片,脱蜡至水,1 mmol/L EDTA抗原修复液(pH=8.0)进行高压抗原修复。3%H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶,山羊血清孵育消除非特异性背景着色。滴加一抗,C/EBP-α浓度为1∶100,Ki-67直接使用,37℃孵育1 h。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗切片3次,滴加二抗,操作步骤按照说明书进行。DAB镜下显色,苏木精复染,镜检。

图1 C/EBP-α在健康对照皮肤和银屑病皮损处的表达(免疫组化二步法×200) 1a:C/EBP-α在健康对照皮肤表皮各层均有表达,主要表达在角质形成细胞胞质;1b:C/EBP-α在银屑病皮损处表

图2 Ki-67在健康对照皮肤和银屑病皮损处的表达(免疫组化二步法×200) 2a:健康对照皮肤在表皮基底层有零星表达,Ki-67主要表达于角质形成细胞胞核;2b:银屑病皮损部位Ki-67在基底层和棘层中下部见广泛表达

4.Western印迹:健康对照皮肤组织和银屑病皮损组织加入含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液,经玻璃匀浆器匀浆直至充分裂解。14 000×g离心5 min,取上清,BCA法测定蛋白浓度。30 μg裂解产物经SDS-PAGE垂直电泳(浓缩胶100 V、分离胶200 V)后以1 mA/cm2半干转电转到PVDF膜上。PVDF膜以5%脱脂奶粉封闭1 h,兔抗人C/EBP-α多克隆抗体4℃孵育过夜(工作浓度1∶400),TBST(含0.1%吐温20的0.01 mol/L的Tris缓冲溶液)充分漂洗后,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白(工作浓度1∶1 000)孵育1 h。采用ECL试剂盒显色,X线片曝光成像,以目的蛋白与β肌动蛋白的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量进行统计学分析。

5.免疫组化结果判定:C/EBP-α以胞质出现黄色至棕黄色颗粒状物质为染色阳性,表达水平以灰度值表示,灰度值越高,阳性程度越低,反之亦然。使用ToupCam显微摄像系统拍摄图片,每个标本随机选取3个视野,通过photoshop16.0软件计算灰度值。Ki-67以胞核内出现黄色至棕黄色颗粒状物质为阳性。增殖指数的计算参见文献[4]。400倍镜下选取染色阳性最强的“热点”区域,计数Ki-67阳性细胞数和总细胞数。增殖指数(PI)即Ki-67阳性细胞数占总细胞数的百分比。

图3 健康对照皮肤与银屑病皮损C/EBP-α蛋白表达检测1,2:健康对照皮肤;3,4:银屑病皮损

6.统计学处理:用SPSS 17.0软件包进行数据的统计学分析,结果均以±s表示,两组C/EBP-α免疫组化染色强度、Western印迹结果及增殖指数比较用独立样本t检验,寻常性银屑病患者C/EBP-α的表达水平与增殖指数及PASI间的相关性分析用Pearson相关分析。所有结果均以P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.C/EBP-α表达水平:C/EBP-α主要在表皮角质形成细胞胞质中表达,接近角质层其表达增强(图1)。经灰度扫描分析,健康对照皮肤中C/EBP-α平均灰度值为51.94±7.60,寻常性银屑病皮损处为85.44±13.88,两组比较,t=7.82,P＜0.05。

2.Ki-67表达及增殖指数:Ki-67在寻常性银屑病组和健康对照皮肤均有表达,但健康对照皮肤中Ki-67阳性细胞仅位于基底层,为零星表达;寻常性银屑病皮损中Ki-67阳性细胞不仅位于基底层,在棘层的中下部也见广泛表达(图2)。健康对照皮肤的增殖指数为6.60%±2.67%,寻常性银屑病皮损为20.00%±9.00%,两组比较,t=4.54,P＜0.05。

3.C/EBP-α表达与增殖指数和PASI评分的相关性:经Pearson相关分析,寻常性银屑病皮损中角质形成细胞C/EBP-α灰度值与增殖指数呈正相关(r=0.65,P＜0.05),与PASI评分呈正相关(r=0.69,P＜0.05),表明寻常性银屑病皮损中角质形成细胞C/EBP-α表达与增殖指数和PASI评分均呈负相关。

4.Western印迹结果:与健康对照皮肤(1.22±0.17)相比,C/EBP-α在银屑病皮损中(0.79±0.22)表达明显下调(t=3.42,P＜0.05,图3)。

三、讨论

转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBP-α)是一种热稳定的转录调节因子,包括C/EBP-αp30和C/EBP-αp42两种蛋白异构体,有三个基本结构域:C端亮氨酸拉链结构域,基本DNA结合区域,N端转录激活区域[1-2]。C/EBP-α在人体肝脏、呼吸道上皮、脂肪组织等多种器官和组织中表达,在细胞能量代谢、炎症反应中发挥作用,参与控制细胞分化,并通过与多种细胞周期蛋白相互作用调节细胞的增殖过程[5-6]。胚胎期表皮,C/EBP-α主要表达在分化的上皮层,并随细胞分化表达逐渐增强,提示其参与调控表皮发生中角质形成细胞分化[7]。Maytin和Habener[5]研究发现,C/EBP-α在棘层中部角质形成细胞胞质中表达,并在棘层上部、颗粒层及角质层表达逐渐加强,表明参与调控角质形成细胞分化。C/EBP-α作为一种抑癌基因,其蛋白产物通过控制细胞周期进程而调控细胞增殖,C/EBP-α表达下调,加剧肿瘤细胞增殖失控及肿瘤发展,而C/EBP-α在这些细胞中的重新表达或表达加强则能抑制细胞增殖[2,8-9]。由此说明,C/EBP-α能够调控包括角质形成细胞的多种类型细胞的分化,并抑制其增殖。

C/EBP-α调控细胞增殖分化的机制尚不明确,目前认为,C/EBP-α能够调节、稳定、活化细胞周期蛋白抑制物p21或直接抑制CDK2和CDK4活性,抑制E2F介导的转录过程等,阻断细胞周期进程,抑制细胞增殖[10-12]。研究表明,Ras能够抑制C/EBP-α表达,而c-myc则被证明为C/EBP-α的作用靶点[13]。还有研究表明,寻常性银屑病皮损中与GTP结合的ras蛋白增加,活性显著增高;c-myc表达显著增强可能与寻常性银屑病皮损中存在角质形成细胞增殖分化异常及细胞周期调控紊乱有关[14]。本研究发现,与健康皮肤比较,寻常性银屑病皮损中C/EBP-α表达明显下调,增殖指数显著升高。C/EBP-α在寻常性银屑病皮损中表达下调可能与角质形成细胞分化异常及过度增殖相关。

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2013-07-19)

(本文编辑:吴晓初)

Expression of the transcription factor CCAAT/enhancer-binding protein alpha in psoriatic lesions and its significance

Jia Kun*,Zhang Xiaofeng,Dong Yuhao,Zhang Yan,Ma Weiyuan.*Shandong University School of Medicine,Jinan 250012,China

Ma Weiyuan,Email:dermatologyqlh@163.com

ObjectiveTo detect the expression of the transcription factor CCAAT/enhancer-binding protein alpha(C/EBP-α)in the epidermis of psoriasis vulgaris lesions,and to investigate its correlation with abnormal keratinocyte proliferation and disease severity.MethodsBiopsy specimens were obtained from the lesions of 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 30 healthy human controls.A two-step immunohistochemical procedure was performed to detect the expressions of C/EBP-α and Ki-67 in these specimens,and Western blot to quantify the expression of C/EBP-α.The proliferation index of keratinocytes was calculated according to the expression intensity of Ki-67.Statistical analysis was carried out by using the SPSS 17.0 software,and Pearson correlation analysis was conducted to assess the relationship of C/EBP-α expression level with proliferation index of keratinocytes and psoriasis area and severity index(PASI)score.ResultsC/EBP-α was predominantly expressed in the cytoplasm of keratinocytes,while Ki-67 in the nuclei of keratinocytes.Compared with the normal skin,the psoriatic lesions showed a significantly lower expression of Ki-67(t=7.82,P＜0.05),but higher proliferation index of keratinocytes(t=4.54,P＜ 0.05).The expression level of C/EBP-α was negatively correlated with the proliferation index of keratinocytes and PASI score in the patients(bothP＜0.05).Western blot also showed an obvious decrease in the expression of C/EBP-α in psoriatic lesions.ConclusionsThe expression of C/EBP-α is decreased in lesions of psoriasis vulgaris,which might be involved in the pathogenesis of psoriasis vulgaris.

Psoriasis;CCAAT-enhancer-binding protein-alpha;Proliferation index

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.017

国家自然科学基金(81071291);山东省自然科学基金(Y2007C003)

250012济南,山东大学医学院(贾琨、张晓峰、董宇昊、张岩);山东大学齐鲁医院皮肤科(马伟元)

马伟元,Email:dermatologyqlh@163.com