转化生长因子β对A431细胞上皮向间质转换相关分子表达的影响

郭圆圆 彭斌 向桂琼 耿松梅

转化生长因子β对A431细胞上皮向间质转换相关分子表达的影响

郭圆圆 彭斌 向桂琼 耿松梅

目的研究转化生长因子β(TGF-β)对人表皮鳞状细胞癌A431细胞上皮向间质转换(EMT)相关分子表达的影响。方法用含7.5 μg/L TGF-β处理A431细胞72 h后观察细胞形态,采用实时定量PCR和Western印迹分别在mRNA水平和蛋白水平检测EMT相关基因E钙黏着蛋白、N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达水平的变化。未经TGF-β处理的A431细胞为对照组。结果TGF-β处理后,A431细胞独立分散,呈梭形。实时定量PCR结果显示,E钙黏着蛋白表达量为未经TGF-β处理组的31.7%,N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达量分别为未经处理组的2.475、11.340、2.615倍;Western印迹结果,N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达量上升,E钙黏着蛋白表达量下降。结论TGF-β可诱导A431细胞产生EMT现象,TGF-β表达量上升,可能参与表皮鳞状细胞癌发生侵袭、转移。

细胞系,肿瘤;转化生长因子β;上皮向间质转化

上皮向间质的转换(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在一定条件下,以一定的顺序丢失极性,失去细胞之间的紧密连接及黏附连接,在形态上转变为间质细胞样,并通过蛋白酶破坏基底膜,从而获得侵袭性与游走能力的现象[1]。近年来,EMT现象在大肠癌[2]、乳腺癌[3-4]、前列腺癌[5]等多种肿瘤的侵袭与转移中起到的作用已得到证实,而鳞状细胞癌(SCC)为我国最常见的表皮肿瘤,较易发生转移,其侵袭和转移是否与EMT相关至今鲜有研究。转化生长因子β(TGF-β)是一组新发现的可由机体多种细胞分泌产生的细胞因子,一般在分化活跃的细胞表达量较高,如肿瘤细胞、成骨细胞、胚胎的造血细胞等[6-7],被认为可能与EMT的发生相关[8]。那么,TGF-β是否可以诱导人表皮SCC A431细胞产生EMT现象并使其具有更强的侵袭及转移能力呢?为此,我们观察TGF-β处理A431细胞后的形态,并采用实时定量PCR和Western印迹技术分别在mRNA水平和蛋白水平检测EMT相关基因E钙黏着蛋白(E-cadherin)、N钙黏着蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、β联蛋白(βcatenin)在TGF-β处理的A431细胞中的表达水平。

材料与方法

一、材料

1.细胞来源:人表皮SCC A431细胞来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

2.主要试剂:重组人TGF-β(美国Peprotech公司),胎牛血清、DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司),胰蛋白酶(美国Gibco公司),鼠抗人E钙黏着蛋白、N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白、β肌动蛋白单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),山羊抗鼠二抗(美国Abcam公司),放射免疫共沉淀(RIPA)裂解液(美国Roche公司),RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒(上海飞捷生物技术公司),逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司),Perfect Real Time试剂盒(日本TaKaRa公司)。

3.主要仪器:JS-380A自动凝胶图像分析仪(上海培清科技公司),SP-1000紫外分光光度计(美国Eppendorf公司),实时定量PCR仪(美国ABI公司)。

二、方法

1.细胞培养:A431细胞为贴壁生长细胞,培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,置于37℃恒温培养箱中以5%CO2饱和湿度条件培养,隔天换液。

2.药物干预:加药组:选取对数生长期A431细胞饥饿过夜,用不含胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释TGF-β原液至7.5 μg/L[9],培养A431细胞72 h。对照组:用不含胎牛血清的DMEM高糖培养基培养同代细胞72 h。在倒置光学显微镜下观察加药组与对照组细胞形态及细胞间连接情况等,并拍照。

3.实时定量PCR:参照总RNA极速抽提试剂盒说明书提取加药组与对照组细胞总RNA,并采用SP-1000紫外分光光度计测定A260/A280比值,以判定RNA纯度。参照Takara公司逆转录试剂盒说明,采用10 μl反应体系,按37℃ 15 min,85℃ 5 s条件进行逆转录反应,所得产物用于实时定量PCR。检索NCBI GenBank数据库获得相关基因序列,实时定量PCR反应引物由宝生物工程(大连)有限公司设计并合成(表1)。20 μl反应体系内含有cDNA模板 2 μl,2 × SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl,ROX Reference Dye 0.4 μl,上游引物0.8 μl,下游引物0.8 μl,DEPC水6 μl。扩增条件为第1步95℃ 30 s,第2步95℃5 s、60℃31 s,共重复40个循环,第3步95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。 以 2-ΔΔCt表示加药组与对照组目的mRNA表达的倍数关系。公式如下:ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)]加药组 -[Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)]对照组。

4.Western印迹检测E钙黏着蛋白、N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白的表达:参照RIPA裂解液说明书分别提取加药组与对照组细胞总蛋白,并采用SP-1000紫外分光光度计测定A260/A280比值,验证蛋白纯度。在蛋白内加入少量上样缓冲液,煮沸5 min。将蛋白以10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(SDS-PAGE),分别切下目的蛋白质所在位置凝胶进行转膜,将硝酸纤维素滤膜放入含吐温Tris缓冲生理氯化钠溶液(TBST)配制的5%脱脂奶粉封闭液中,37℃温育2 h,硝酸纤维素滤膜与相应鼠抗人一抗抗体工作液共同4℃孵育过夜,TBST洗膜液漂洗3次,二抗孵育1 h,TBST洗膜液漂洗3次,加入发光剂,于自动凝胶图像分析仪下调节发光时间并拍照。

表1 实时定量PCR引物序列

结 果

一、TGF-β处理对A431细胞形态的影响

倒置光学显微镜下观察:以不含TGF-β的无胎牛血清的高糖DMEM培养基培养的A431细胞整体轮廓呈铺路石样,聚集呈团块状,细胞呈鹅卵石形或多角形,胞质透亮(图1a);在含7.5 μg/L TGF-β的无胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养72 h后,可见细胞呈梭形,细胞间隙增大,细胞独立不融合(图1b)。

二、TGF-β处理对A431细胞EMT相关基因mRNA表达的影响

利用上述E钙黏着蛋白、N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白及GADPH引物扩增的基因片段,其熔解曲线具有扩增的一致性,PCR扩增呈指数生长且具有平台期。加药组E钙黏着蛋白表达量为对照组的31.7%,N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达量分别为对照组的2.475、11.340、2.615倍。

三、TGF-β处理对A431细胞EMT相关基因蛋白表达的影响

经检测N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达量上升,E钙黏着蛋白表达量下降,与mRNA表达量变化一致(图2)。

图1 转化生长因子β处理A431细胞前后细胞形态比较(×400) 1a:对照组,细胞呈鹅卵石样,团块状分布;1b:转化生长因子β处理组,细胞呈梭形,分散呈单个分布

图2 Western印迹检测A431细胞上皮向间质转化相关基因蛋白表达 1:对照组;2:转化生长因子β处理组

讨 论

最初,人们发现EMT现象时,认为它是胚胎发育过程中胚胎发生形态学变化的重要因素[7]。然而,随着对EMT现象研究的深入,人们越来越关注EMT现象在早期肿瘤向侵袭性肿瘤及肿瘤的远处转移过程中起到的作用[10-12]。EMT现象的发生总是伴随着上皮相关的基因水平下调及间质相关的基因水平上调。如参与上皮细胞间的黏附连接并维持上皮细胞极性的E钙黏着蛋白的下调及间质细胞特异性的波形蛋白、N钙黏着蛋白的表达上调等[13]。而在肿瘤团块中,这些基因的表达改变,引起肿瘤细胞间紧密连接及黏附连接丢失、细胞骨架破坏,导致细胞顶端变窄、基底膜带结构紊乱,使肿瘤细胞溢出基底膜带向周围迁徙并进入血管、淋巴管等发生转移[14]。

有研究表明,上皮样肿瘤细胞表达E钙黏着蛋白,不具有穿透Marigel(一种包含胶原、蛋白多糖、细胞因子及多种酶类并模仿机体细胞膜的物质)的能力;而纤维细胞样肿瘤细胞E钙黏着蛋白表达量低,可以穿透Marigel,将E钙黏着蛋白的cDNA转染到此类细胞中,其侵袭能力受到抑制。说明纤维细胞样肿瘤细胞可能是由上皮样肿瘤细胞E钙黏着蛋白表达量下降转化而来[10]。如果发现了刺激这种转化的因素,有可能推断肿瘤恶性程度升高的原因。

近来研究提出,当机体受到TGF-β刺激后,可能可以通过TGF-β-Smad信号通路及TGF-β-non-Smad信号通路诱发EMT现象,进而引起ZO-1、波形蛋白等表达上调,E钙黏着蛋白等表达下调等,从而使上皮来源的肿瘤细胞转化为间质细胞,细胞间的黏附能力下降,造成肿瘤细胞的侵袭和转移[15]。

本课题组利用人表皮SCC细胞系A431细胞,观察TGF-β处理组细胞与未经TGF-β处理组细胞的形态变化及EMT相关基因表达的变化。发现经TGF-β处理,A431细胞在形态上向间质细胞转化、细胞间隙增宽,在mRNA及蛋白水平上发生E钙黏着蛋白表达量下降,N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达量上升现象,符合发生EMT现象的变化。推测TGF-β的确是刺激人表皮鳞状细胞癌肿瘤细胞内在构成性信号通路发生变化,发生EMT现象,从而使其具有更强的侵袭及转移能力。抑制TGF-β与其受体的结合为降低SCC的恶性程度提供了一种新的思路。

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2013-09-04)

(本文编辑:尚淑贤)

Effects of transforming growth factor-β on the expressions of epithelial-to-mesenchymal transition-related molecules in A431 cells

Guo Yuanyuan,Peng Bin,Xiang Guiqiong,Geng Songmei.Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China

Geng Songmei,Email:gsm312@yahoo.com

ObjectiveTo evaluate the effect of transforming growth factor-β(TGF-β)on the expressions of epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)-related molecules in human A431 epidermal squamous cell carcinoma cells.MethodsCultured A431 cells were classified into two groups:TGF-β group treated with TGF-β of 7.5 μg/L for 72 hours,and control group remaining untreated.Subsequently,cell morphology was observed under an inverted microscope,and real time-PCR and Western blot were performed to quantify the mRNA and protein expressions of EMT-related molecules including E-cadherin,N-cadherin,vimentin and β-catenin respectively.ResultsAfter TGF-β treatment,the cells became dispersed and spindle in shape.The mRNA expression levels of E-cadherin,N-cadherin,vimentin,and β-catenin in TGF-β group were 0.317,2.475,11.340 and 2.615 folds those in the control group respectively.Western blot showed a marked increase in the expression of N-cadherin,vimentin,and β-catenin proteins but a notable decrease in that of E-cadherin in the TGF-β group compared with the control group.ConclusionsTGF-β can induce EMT in A431 cells,and increased expression of TGF-β may contribute to the invasion and metastasis of SCC.

Cell line,tumor;Transforming growth factor beta;Epithelial-to-mesenchymal transition

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.010

国家自然科学基金面上项目(81372912);教育部新世纪人才支持计划(NCET-10-0673);西安交通大学第二附属医院基金[YJ(ZD)201219]

710004西安交通大学第二附属医院皮肤科

耿松梅,Email:gsm312@yahoo.com