银屑病患者血清白介素36及其受体拮抗剂表达水平与病情严重度的相关性研究

舒丹 晋红中 王宝玺 苏飞 李峰

银屑病患者血清白介素36及其受体拮抗剂表达水平与病情严重度的相关性研究

舒丹 晋红中 王宝玺 苏飞 李峰

目的探讨银屑病患者血清白介素(IL)36(IL-36α、IL-36β、IL-36γ)及其受体拮抗剂IL-36Ra水平与银屑病病情严重度的相关性。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)比较45例泛发性脓疤性银屑病(GPP)患者、34例寻常性银屑病(PV)患者和37例健康对照者血清IL-36及IL-36Ra水平,并结合患者病情严重度进行相关性分析。结果IL-36及IL-36Ra在3组之间表达差异无统计学意义。银屑病患者按病期分组后,GPP脓疤发作期患者27例血清IL-36β、γ表达水平(中位数±四分位数间距分别为12.101±11.315和34.541±15.580 ng/L)显著高于健康对照组(分别为5.355±9.020和23.052±22.410 ng/L),经非参数Mann-Whiteney检验,差异均有统计学意义(P＜0.05)。按病情严重度分组后,重度GPP患者7例血清IL-36β、γ表达水平(分别为11.218±9.318和38.536±17.332 ng/L)均显著高于健康对照组(P＜0.01)。GPP组、PV组及健康对照组IL-36β与γ表达水平均呈显著正相关(r值分别为0.85、0.86、0.91,均P＜0.01);且两者均与GPP病情严重度呈低度正相关(r值分别为0.33、0.41,均P＜0.05);IL-36β表达水平尚与PV皮损面积严重指数显著正相关(r=0.54,P＜0.01)。结论GPP患者血清IL-36β、γ水平与病情严重度呈低度正相关,提示IL-36β、γ可能在GPP的发病中发挥重要作用。

银屑病;白细胞介素36;白细胞介素36受体拮抗剂

近年研究发现,白介素(IL)36及其受体拮抗剂IL-36Ra与银屑病的发病密切相关,IL-36能启动皮肤中抗菌肽的表达,从而激活银屑病样基因的表达,引起银屑病的发生[1]。IL-36RN(编码IL-36Ra的基因)突变可导致泛发性脓疤性银屑病(GPP)的发生[2-4]。IL-36及IL-36Ra主要由角质形成细胞产生,在皮损局部发挥作用[5],是否IL-36及IL-36Ra在GPP、寻常性银屑病(PV)患者血清中也发挥作用?其水平与病情是否相关?本研究通过检测GPP、PV患者及健康人血清中IL-36及IL-36Ra表达水平,分析其与病情严重度的相关性,探讨其在银屑病发病机制中的作用。

资料与方法

一、临床资料

选取我科2012年1月至2013年10月经临床或病理确诊的45例GPP和34例PV患者。GPP组男28例,女17例,年龄5～66岁,中位年龄28.5岁;PV组男19例,女15例,年龄6～65岁,中位年龄29.0岁。GPP患者均符合Umezawa诊断标准[6],入组时根据脓疤情况分为脓疤发作期(有新发脓疤,伴或不伴发热)27例、脓疤消退期(无新发脓疤、发热,脓疤部分消退或完全消退)18例;根据Umezawa[6]病情评估标准,分为轻度(0～2分)18例、中度(3～6分)20例、重度(7～10分)7例。

PV患者均符合诊断标准[7],进展期20例,非进展期14例;根据皮损面积严重指数(PASI)标准[8],分为轻度(PASI＜7)14例,中重度(PASI≥ 7)20例。所有患者无其他系统性或免疫性疾病,2周内未系统性应用糖皮质激素、维A酸制剂、免疫抑制剂及生物制剂治疗。健康对照组37例,其中男22例,女15例,年龄6～68岁,中位年龄30.2岁。经统计学分析,3组间在年龄、性别方面差异均无统计学意义。本研究经北京协和医院伦理委员会批准,所有患者及健康对照者均签署知情同意书。

二、主要试剂与仪器

人 IL-36α、IL-36β、IL-36γ及IL-36Ra试剂盒产自上海延吉生物科技有限公司,Synergy Hybrid酶标仪由美国Biotek公司生产。

三、方法

征得患者知情同意后,填写临床资料存档,记录GPP患者病情评分及PV患者PASI,采集肘正中静脉血4 ml,分离血清,分装后放-80℃冰箱保存待测。

1.IL-36、IL-36Ra检测:采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-36、IL-36Ra水平,具体操作按照说明书进行。将加样板置于波长450 nm酶标仪读取各孔吸光度(A值),并建立标准曲线,按曲线方程计算各样本浓度。敏感度:IL-36α＜0.1 ng/L,IL-36β、γ 及Ra均 ＜1.0 ng/L。 变异系数:板内、板间均＜15%。

2.统计学方法:采用SPSS 17.0统计软件进行处理,数据非正态分布,检验结果以中位数±四分位数间距表示,GPP、PV组间及与健康对照组间比较采用非参数Mann-Whiteney检验,患者血清IL-36、IL-36Ra水平之间及其与病情严重度的相关性比较采用Spearman等级相关检验(秩和检验)。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者和健康人血清IL-36、IL-36Ra表达水平

GPP组、PV组分别与健康对照组比较及GPP组与PV组比较,血清IL-36及IL-36Ra水平差异均无统计学意义(均P＞0.05)。见表1。

表1 泛发性脓疤性银屑病(GPP)和寻常性银屑病(PV)患者血清白介素36(IL-36)及其受体拮抗剂(IL-36Ra)表达水平(中位数±四分位数间距) ng/L

二、按病期分组后患者和健康人血清IL-36、IL-36Ra表达水平

GPP脓疤发作期患者血清IL-36β、γ表达水平显著高于健康对照组、GPP脓疤消退期及PV非进展期,GPP脓疤发作期IL-36β与各组比较Z值分别为3.58、4.17、3.66,IL-36γ与各组比较Z值分别为2.70、4.32、3.22,均P＜0.01。 GPP脓疤发作期患者血清IL-36β表达水平高于PV进展期(Z=2.58,P＜0.05)。其余细胞因子血清表达水平在GPP、PV患者各分期组间差异均无统计学意义(均P＞0.05),与健康对照组相比差异也均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

三、按病情严重度分组后患者IL-36、IL-36Ra表达水平

中度、重度GPP患者血清IL-36β表达水平高于健康对照组(Z值分别为2.40、2.20,均P＜0.05)。重度GPP患者血清IL-36β表达水平高于轻度PV患者(Z=2.78,P＜0.01),血清IL-36γ表达水平高于健康对照组、轻度GPP患者及轻度PV患者(Z值分别为 2.00、2.66、2.71,P值分别 ＜ 0.05、＜ 0.01、＜0.01)。其余细胞因子血清表达水平在GPP、PV患者不同病情组间差异均无统计学意义(P＞0.05),与健康对照组相比差异亦均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 不同病情泛发性脓疤性银屑病(GPP)和寻常性银屑病(PV)患者血清白介素36(IL-36)及其受体拮抗剂(IL-36Ra)表达水平(中位数±四分位数) ng/L

四、相关性分析

1.银屑病患者血清IL-36、IL-36Ra表达水平的相关性分析:GPP、PV组患者及健康对照组血清中IL-36β与γ表达水平均呈高度正相关(r值分别为0.85、0.86、0.91,均P＜0.01)。PV患者血清中IL-36α与β表达水平呈显著正相关(r=0.70,P＜0.01),IL-36α与γ高度正相关(r=0.82,P＜0.01),IL-36α与Ra低度负相关(r=-0.38,P＜0.05)。而健康对照组血清中IL-36α与β表达水平呈显著正相关(r=0.58,P＜0.01),IL-36α与γ低度正相关(r=0.48,P＜0.01)。其余细胞因子表达水平在患者及健康对照组血清中均无显著相关性(均r＜0.3,P＞0.05)。

2.银屑病患者血清IL-36、IL-36Ra表达水平与病情严重度的相关性分析:GPP组患者IL-36β、γ血清表达水平均与病情严重度呈低度正相关(r值分别为0.33、0.41,均P＜0.05)。PV组患者PASI与IL-36α血清表达水平呈低度正相关(r=0.44,P＜0.01),与IL-36β显著正相关(r=0.54,P＜0.01),与IL-36γ低度正相关(r=0.40,P＜0.05)。其余细胞因子水平与病情严重度均无相关(均r＜0.30,P＞0.05)。

讨 论

IL-36是IL-1家族成员,由3个生物学功能相似的分子 IL-36α、IL-36β 及 IL-36γ组成[1,9]。IL-36在体内需通过与特异性受体IL-36R(曾称为IL-1Rrp2或IL-1RL2)结合而发挥促炎症作用,而IL-36Ra是其受体拮抗剂。IL-36和IL-36R、IL-36Ra主要在上皮组织如皮肤、气管、食道中表达[5]。角质形成细胞、单核细胞和B细胞受刺激后活化可产生IL-36[5]。 IL-36、IL-36R与IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)组成一条新的IL-1家族的信号传导通路,启动靶基因的表达,发挥促炎症作用,IL-36Ra与IL-36R结合后的复合物不能再与IL-1RAcP结合,从而不能激活信号转导通路而起到抗炎症作用[1,9]。IL-36及IL-36Ra与银屑病的发病密切相关,IL-36α转基因小鼠皮肤中IL-36α过度表达,出现皮肤增厚、表面多层鳞屑,组织病理表现为棘层肥厚、真皮内炎细胞浸润,与人银屑病皮损相似,且皮损中 IL-17、IL-22、IL-23、抗菌肽等银屑病相关基因表达增多[10]。缺失IL36RN的IL-36α转基因鼠病死率高,皮肤产生广泛脓疤,组织病理学表现为表皮内脓疤[10],与人GPP临床表现相似。PV患者皮损中IL-36、IL-36Ra表达及其mRNA合成显著增加[1,11-12],PV患者皮损的维持需要IL-36持续表达[12],经肿瘤坏死因子α(TNF-α)治疗后的PV患者皮损中IL-36、IL-36Ra表达显著减少[1]。GPP患者存在IL36RN突变[2-4],突变IL36RN所产生的异常IL-36Ra量很少,且不能拮抗IL-36的作用,导致炎症因子在患者皮损中过度表达,可能为GPP的发病机制之一[4]。

我们采用ELISA法对GPP、PV组患者及健康对照组血中IL-36、IL-36Ra水平进行检测,结果显示,IL-36及IL-36Ra在3组之间表达无差异,按病期分组后IL-36β、γ表达水平在GPP脓疤发作期显著升高,按病情严重度分组后IL-36β、γ表达水平在重度GPP患者显著升高。相关性分析结果显示,IL-36β与γ表达水平在GPP、PV及健康对照组中均呈高度正相关,且两者均与GPP病情严重度呈低度正相关。以上研究结果提示,IL-36β与γ在GPP患者血清中可能有相似的生物学活性,其水平的升高是GPP发病机制的重要组成部分,可能参与GPP的发生及发展过程。而IL-36α、Ra血清表达水平在3组间无异常,且与病情严重度无关,然而IL-36α与β、γ表达水平在健康对照者及PV患者呈不同程度的正相关,而在GPP患者中则无相关,提示IL-36α在银屑病患者血清中的作用机制可能与IL-36β、γ稍有差异,具体机制尚待进一步研究。IL-36Ra是否在银屑病患者血清中参与发病,本文尚不能证实。由于其所拮抗的炎症因子如IL-36β、γ等在GPP发作期及重度GPP患者中显著升高,结合GPP患者存在IL36RN突变[6-8],且异常IL-36Ra不能拮抗IL-36作用这一理论,推测血清中IL-36Ra在GPP患者中可能参与发病。鉴于ELISA法并不能区分异常、正常IL-36Ra,且仅部分GPP存在IL36RN突变,最终GPP患者并未出现血清IL-36Ra表达水平的显著降低。关于IL-36Ra在银屑病发病中的作用需进一步行IL36RN基因检测、体外功能试验。

虽然PV患者IL-36、IL-36Ra水平按病期、PASI分组后各组间并无差异,与健康对照组也无差异,但是IL-36α、β、γ与PASI呈不同程度的正相关,因此IL-36、IL-36Ra在PV患者血清中的作用机制尚需进一步证实。

综上所述,血清中IL-36β、γ可能在GPP的发病过程中发挥重要作用,其水平与病情严重程度相关。其余IL-36相关细胞因子在银屑病患者血清中的作用尚需扩大样本量、丰富检测方法以进一步证实。

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2013-05-20)

(本文编辑:颜艳)

Serum levels of interleukin-36 and its receptor antagonist in patients with psoriasis and their correlations with disease severity

Shu Dan*,Jin Hongzhong,Wang Baoxi,Su Fei,Li Feng.*Department of Dermatology,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100730,China

s:Jin Hongzhong,Email:jinhongzhong@263.net;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

ObjectiveTo evaluate the relationship of serum levels of interleukin(IL)-36α,IL-36β and IL-36γ as well as their receptor antagonist IL-36Ra with disease severity in patients with psoriasis.MethodsVenous blood samples were collected from 45 patients with generalized pustular psoriasis(GPP),34 patients with psoriasis vulgaris(PV),and 37 healthy human controls.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to determine the serum levels of IL-36α,IL-36β,IL-36γ and IL-36Ra.Nonparametric Mann-Whitney test was conducted to compare the levels of IL-36 and IL-36Ra among these groups,and Spearman's rank correlation analysis to assess the relationship between the serum levels of IL-36 and IL-36Ra and disease severity.ResultsNo statistical difference was observed in the serum levels of IL-36 or IL-36Ra among the patients withGPP,patients with PV,and healthy human controls.The serum levels of IL-36β and IL-36γ (given as the median±interquartile range)were significantly higher in 27 patients with GPP during episodes of pustules((12.101±11.315)ng/L and(34.541±15.580)ng/L respectively)and in 7 patients with severe GPP((11.218±9.318)ng/L and(38.536±17.332)ng/L respectively)than in the healthy human controls((5.355±9.020)ng/L and(23.052±22.410)ng/L respectively,P＜ 0.05 or 0.01).The serum level of IL-36γ was positively correlated with that of IL-36β in patients with GPP,patients with PV,and the healthy human controls(r=0.85,0.86,0.91,respectively,allP＜0.01),and both IL-36β and IL-36γ serum levels were lowly and positively correlated with the severity of GPP(r=0.33,0.41,respectively,bothP＜0.05).A positive correlation was also observed between the serum level of IL-36β and psoriasis area and severity index(PASI)scores in patients with PV(r=0.54,P＜0.01).ConclusionsThe serum levels of IL-36β and IL-36γ are lowly and positively correlated with disease severity in patients with GPP,suggesting that IL-36β and IL-36γ play an important role in the pathogenesis of GPP.

Psoriasis;Interleukin-36;Interleukin-36 receptor antagonist

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.005

卫生公益性行业科研专项经费(201002016)教育部博士点基金(20121106110047)

100730北京,中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院皮肤科(舒丹、晋红中、苏飞、李峰);中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所(王宝玺)

晋红中,Email:jinhongzhong@263.net;王宝玺,Email:wangbx@ncstdlc.org