清化饮对慢性胃炎脾胃湿热证胃黏膜蛋白的影响

付肖岩，陈小玲，王 薇，胡光宏，徐从荣，林 平，高尤亮

（福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州350003）

慢性胃炎为临床常见病、多发病，病程长，往往缠绵不愈，严重影响患者的生活质量。脾胃湿热证是慢性胃炎常见的实证，有研究显示399例慢性胃炎中，属脾胃湿热证 209 例（占 52.38%）［1］。目前研究显示中医药对其治疗效果显著高于西药［2-4］。清化饮是我国名老中医杨春波主任医师治疗慢性胃炎脾胃湿热证的经验方，具有良好的临床疗效［5］，但清化饮治疗慢性胃炎脾胃湿热证的作用机制目前尚未阐明。本实验应用双向凝胶电泳技术研究清化饮对慢性胃炎脾胃湿热证患者胃黏膜蛋白的影响，以期为清化饮治疗慢性胃炎脾胃湿热证作用机制提供进一步的理论依据。

1 临床资料

1.1 病例选择条件

1.1.1 西医诊断标准 参照2012年中华医学会消化病学分会制定的《中国慢性胃炎共识意见》［6］。胃镜诊断标准：慢性非萎缩性胃炎胃镜下可见黏膜红斑，黏膜出血点或斑块，黏膜粗糙伴或不伴水肿，及充血渗出等基本表现。慢性萎缩性胃炎胃镜下可见黏膜红白相间，以白相为主，皱襞变平甚至消失，部分黏膜血管显露，可伴有黏膜颗粒或结节状等表现。

病理诊断标准：① 慢性炎症 正常：单个核细胞每高倍视野不超过5个，如数量略超过正常而内镜下无明显异常，病理可诊断为基本正常；轻度：慢性炎症细胞较少并局限于黏膜浅层，不超过黏膜层的1／3；中度：慢性炎症细胞较密集，不超过黏膜层2／3；重度：慢性炎症细胞密集，占据黏膜全层。②活动性0：慢性炎症背景上无中性粒细胞浸润；+：黏膜固有层有少数中性粒细胞浸润；++：中性粒细胞较多存在于黏膜层，可见于表面上皮细胞、小凹上皮细胞或腺管上皮内；+++：中性粒细胞较密集，或除中度所见外还可见小凹脓肿。③ 萎缩 轻度：固有腺体减少不超过原有腺体的1／3来计算；中度：固有腺体数减少介于原有腺体的1／3～2／3；重度：固有腺体数减少超过2／3，仅残留少数腺体，甚至完全消失。④ 肠化轻度：肠化区占腺体和表面上皮总面积1／3以下；中度：肠化区占腺体和表面上皮总面积1／3～2／3；重度：肠化区占腺体和表面上皮总面积2／3以上。

1.1.2 脾胃湿热证辨证标准 参照2011年中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会制定的《慢性胃炎的中西医结合诊疗共识意见》［7］，主症：① 胃脘痞胀或疼痛；②舌质红，苔黄腻或黄厚。次症：①胃脘灼热；② 口臭口苦；③ 恶心呕吐；④ 大便黏滞；⑤脉滑数或濡数。判断：具备主症2项加次症1项，或主症第1项加次症2项即可诊断。

1.1.3 纳入标准

1.1.3.1 健康对照组 ①年龄大于18岁且小于60岁的健康体检者；②经本院体检中心检查排除主要脏器的器质性疾病及糖尿病等内分泌疾病者；③镜下黏膜正常，且无上消化道不适症状；④ 同一部位（胃窦部）的3块活检标本病理提示为正常和／或轻度浅表性炎症者。

1.1.3.2 治疗组 ① 年龄大于18岁且小于60岁的患者；② 符合西医慢性胃炎诊断标准者；③ 符合中医脾胃湿热证辨证标准者。

1.1.4 排除标准 ①18岁以下或60岁以上患者，妊娠或哺乳期妇女；② 合并心血管、脑血管、肝肾和造血系统等严重原发性疾病，精神病患者；③ 实验前2周服用过抑酸药物、糖皮质激素、非甾体类抗炎药和抗生素者。

1.2 一般资料 30例患者均来源于我院2013年2月—2013年12月消化内科门诊及病房。其中男15例，女 15例；年龄 30～57岁，平均年龄（38±8.26）岁；病程1个月～8 a。同时按照简单随机抽取方法选取我院2013年2月—2013年12月健康体检者30例作为健康对照组。其中男17例，女13例；年龄28～59 岁，平均年龄（40±7.15）岁。

2 材料与方法

2.1 材料 清化饮由绵茵陈、薏苡仁、厚朴、生扁豆、黄连、赤芍、白豆蔻、佩兰等组成（我院院内制剂，500 mL／瓶，生产批号：130210）；固相 pH 梯度干胶条（24 cm，pH 3～10）、两性电解质（pH 3～10）、蛋白质浓度测定试剂盒均购自北京中原合聚经贸有限公司；等电聚焦仪PROTEAN IEF Cell、电泳仪 Power／PAC 3000、PROTEAN DodecaCell 垂 直 电 泳 仪 、GS710扫描仪 （Bio-Rad）、PDQuest 8.0软件均购自biorad公司。

2.2 治疗方法 治疗组服用清化饮，每次20 mL，每日3次，餐前半小时口服，疗程共1个月。

2.3 标本采集及保存 健康对照组、治疗组胃黏膜组织标本均在我院胃镜室收集，每个标本取5块（胃窦2块取自距幽门2～3 cm处的大弯和小弯；胃体2块取自距贲门8 cm处的大弯和小弯；胃角1块，约距胃角近侧4 cm）。活检样本用生理盐水反复冲洗以去除血液等污染后，在30 min内保存于标记好的冻存管中-80℃冰箱保存。

2.4 胃黏膜总蛋白的提取 ① 用液氮预冷的砸碎器将组织砸碎，再用液氮将砸碎的粉末研磨，加入Cocktail蛋白酶抑制剂。②将一部分lysis加入样品粉末中，将其溶解，再转入Dounce匀浆器中，上下匀浆10次。③将样品放入烧杯里超声，超声杯必须装有冰水混合物，按照21%振幅进行超声。④在冰上提取，时间为 30 min。 ⑤ 离心（14000 g×1 h），弃沉淀取上清。

2.5 双向凝胶电泳 用双向凝胶电泳（2-DE）方法进行蛋白质分离，利用考马斯亮蓝染色方法［8］进行电泳凝胶染色。

2.6 凝胶图像采集及分析 银染后的双向凝胶应用GS710扫描仪进行扫描，图像分析使用PDquest 8.0软件。分析包括蛋白质斑点的检测、量化、背景去除和点的匹配。

3 治疗结果

3.1 疗效判断标准 参照2011年中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会制定的《慢性胃炎的中西医结合诊疗共识意见》［7］。胃镜及病理疗效判定标准：①治愈：胃镜复查活动性炎症消失，慢性炎症好转达轻度，腺体萎缩、肠化生和异型增生消失；②显效：黏膜急性炎症基本消失，慢性炎症好转，腺体萎缩、肠化生和异型增生明显减轻；③ 有效：黏膜病变范围缩小1／2以上，炎症有所减轻，腺体萎缩、肠化生和异型增生减轻；④ 无效：内镜及病理所见均无好转者。中医证候疗效判定标准：①临床痊愈：主要症状、体征消失或基本消失，疗效指数≥95%；②显效：主要症状、体征明显改善，70%≤疗效指数＜95%；③ 有效：主要症状、体征明显好转，30%≤疗效指数＜70%；④ 无效：主要症状、体征无明显改善，甚或加重，疗效指数＜30%。

疗效指数＝［（治疗前积分－治疗后积分）／治疗前积分］×100%。

所有症状均分为无、轻、中、重4级，主症分别记以 0、2、4、6 分，次症分别记以 0、1、2、3 分。

3.2 治疗组疗效 ① 中医证候疗效：治愈率为3.33%，显效率为33.33%，有效率为60%，总有效率96.67%。② 胃镜下疗效：治愈率为10%，显效率为30%，有效率为53.33%，总有效率93.33%。③ 病理疗效：治愈率为0%，显效率为26.67%，有效率为53.33%，总有效率80%。

3.3 实验结果 在相同条件下分别对各组胃黏膜总蛋白进行双向凝胶电泳分离，考马斯亮蓝染色后获得各组的2-DE图谱，见图1。再经GS710扫描仪扫描后，经PDQuest8.0图像分析软件分析，每块双向凝胶可分离近600个左右蛋白质点。3次双向凝胶电泳图谱有极大相似形，在相同的设定值下获得了健康对照组、治疗组治疗前、治疗后胃黏膜蛋白质点数依次为（510±22）个、（527±49）个、（526±30）个。经图像分析统计后发现：治疗组与健康对照组比较有21个蛋白表达上调，10个蛋白表达下调；治疗组治疗前后比较，表达上调21个蛋白质中有18个表达降低，而表达下调10个蛋白质中有9个表达增强。各差异蛋白质点见表1。

4 讨 论

清化饮作为治疗慢性胃炎脾胃湿热证的一个代表方，具有良好的临床疗效，然而目前对于清化饮的研究只停留在药效观察水平，国内外均未见清化饮对慢性胃炎脾胃湿热证患者胃黏膜蛋白影响的文献报道。差异蛋白质组学是针对动态变化着的蛋白质组的整体来进行比较，分析不同蛋白质组表达上的差异，可以发现与疾病相关的特异蛋白质，而这些特异蛋白质不仅可作为疾病诊断及治疗的标志物，还可为疾病的致病机制提供线索［9-10］。故本实验应用蛋白质组学方法，研究清化饮对慢性胃炎脾胃湿热证胃黏膜蛋白的影响。

图1 3组胃黏膜2-DE图谱

表13组有明显差异的蛋白质点

清化饮方中绵茵陈性苦微寒，以其善能清热利湿，又因其长于三月独得春升之气，故入肝经兼能上行，为君药；薏苡仁利水渗湿而健脾；生扁豆味甘性微温，能醒脾化湿；白豆蔻化湿行气，温中止呕；佩兰能化湿解暑；辅以苦寒之黄连清热燥湿；配以辛温之厚朴化湿理气除满；佐以赤芍以清热凉血，散瘀止痛。全方药性平和，药味精，药量轻，寒温并用，共奏清热化湿、理气活血之功。本研究从中医证候疗效、胃镜下疗效、病理疗效等多方面观察，结果发现清化饮能有效减轻临床症状，改善慢性胃炎脾胃湿热证患者胃镜下及病理表现。因此，清化饮治疗慢性胃炎脾胃湿热证有良好的临床疗效。

蛋白质组学研究之所以能迅速发展，要归功于双向凝胶电泳技术的创立和不断完善，它是分离组织细胞蛋白质组分的核心技术［11］。所以，建立图像清晰、分辨率高和重复性好的2-DE图谱是蛋白质组学研究的关键。因此，本实验对胃黏膜标本的采集、总蛋白的提取、2-DE的上样量进行了多次的摸索，在样品、双向凝胶的制备及考马斯亮蓝染色等过程中尽量保持其统一性，获得了图像清晰、分辨率高和重复性好的胃黏膜蛋白的2-DE图谱。经图像分析统计后发现：慢性胃炎脾胃湿热证患者与正常人比较有21个蛋白表达上调，10个蛋白表达下调，表明胃黏膜蛋白质表达异常可以作为慢性胃炎脾胃湿热证的临床诊断标志物之一；慢性胃炎脾胃湿热证清化饮治疗前后比较，表达上调21个蛋白质中有18个表达降低，而表达下调10个蛋白质中有9个表达增强，表明清化饮治疗慢性胃炎脾胃湿热证可能是通过调节胃黏膜蛋白的表达而实现。具体是什么蛋白质起作用，有待进一步进行质谱分析。

中医证候具有整体性、动态性和异病同证、同病异证等特征，建立能反映证候本质并能区别他证的定性、定量、定位综合实验指标具有重要的临床意义［12］。从蛋白质水平探讨中医辨证论证的实质，将进一步提高中医对疾病规律的认识和治疗水平，有助于疾病的早期诊断和治疗。

［1］杨春波，黄可成，肖丽春，等.脾胃湿热证的临床研究400例资料分析［J］.中医杂志，1994，35（7）：425.

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［4］于鹤轩.蒿芩清胆汤加味治疗慢性胃炎脾胃湿热证临床观察［J］.辽宁中医药大学学报，2007，9（1）：97-98.

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