固定化费氏丙酸菌增菌工艺条件的初步研究

2014-12-04揣玉多马志刚王德培

饲料工业 2014年1期

揣玉多马志刚王德培

（1.天津现代职业技术学院，天津 300350；2.天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

丙酸及其盐是理想的饲料抗真菌剂，我国作为世界饲料生产大国，对丙酸的需求量很大，而我国丙酸年产量不足200 t，主要依赖进口。为解决以上问题，世界各国科技界和工业界都在寻找和研究解决的方法，丙酸菌等多菌种联合发酵饲料成为目前较好的解决方法。丙酸菌可代替丙酸用作微生物饲料添加剂解决目前丙酸供需矛盾的问题；又可作为饲料发酵剂添加菌种之一，充分利用我国的纤维素资源，将农作物秸秆用于微贮饲料，变废为宝，有效解决养殖业所需的饲料粮问题。本文旨在研究固定化费氏丙酸菌的增菌条件，供上罐发酵参考。

1 实验材料与方法

1.1 菌种及培养基

费氏丙酸杆菌（P.freudeneichii）的突变株Pf 007，由本实验室保存。

1.2 培养基

基础培养基（g/l）：蔗糖20，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸铵5，pH值7.2

1.3 方法

1.3.1 固定化菌体的制备

① 菌悬液的制备

取丙酸菌发酵液200 ml放入离心杯中，18 000 r/min，离心10 min，去除清液，再加入生理盐水摇匀，然后离心洗涤两次。加入60 ml无菌水摇匀制成菌悬液。

② 包埋剂的制备

按3%∶3%的比例称取一定量的聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（CA），加入15 ml去离子水加热融化，搅拌至充分混合，封口，放置到灭菌锅，于115℃下灭菌20 min。

③ 交联剂的制备

配成3%的氯化钙溶液即为交联剂。

④ 固定化凝胶小球的成型

按5 ml菌悬液加入0.6 g麸皮的比例，向菌悬液中加入麸皮，混匀，然后将配好的包埋剂倒入上述混合液中，混匀，利用注射器吸取并滴入3%（w/v）的氯化钙中。

⑤ 交联

完成上述工作后，将该小球交联24 h以保证它的强度。交联24 h后，用生理盐水冲洗。然后转到生理盐水中，放到4℃冰箱保存。

1.3.2 丙酸菌的培养方法

1.3.2.1 斜面种子培养

取一环菌泥在斜面上划线接种，于30℃下培养24 h。

1.3.2.2 液体种子培养

由斜面取一环丙酸菌接种于50 ml基础培养基中，于250 ml三角瓶，30℃，180 r/min摇床培养12 h。

1.3.2.3 摇瓶发酵

以1%的接种量将液体种子接入装有50 ml基础培养基的250 ml的三角瓶中，30℃，180 r/min培养24 h。

1.3.3 菌体浓度的测定方法

丙酸菌的活菌计数采用平板倾注法。

1.4 培养基优化

以基础培养基为基准，保证培养基碳元素、氮元素含量一致设计正交实验L9（34），

表1 培养基配比L9（34）正交试验因素水平

将正交实验中的培养基取代摇瓶发酵中的基本培养基进行好氧培养，测定发酵液的活菌数。根据各组实验活菌数的结果，方差分析确定较好的培养基配比作为丙酸菌发酵罐使用的培养基。

1.5 培养条件优化

以摇瓶发酵条件为基础，设计正交实验L9（34），如表2：

表2 培养条件L9(34)正交试验因素水平

将实验中对应条件作相应改变，其他条件不变进行摇瓶发酵，根据各组实验活菌数的结果，方差分析确定较好的培养条件供上罐发酵参考。

2 结果与讨论

2.1 增菌培养基条件优化

根据方法1.4节进行正交实验，结果如表3和表4。

表3 正交实验结果及极差分析

表4 正交实验方差分析

从表3和表4中可以看出，每个因素对菌种增菌都有一定影响，影响因素主次顺序是B＞C＞D＞A，即影响最显著的是氮源，其次是微量元素，而影响最小的是碳源。选取最好水平组合，因素A（碳源）中，水平3（乳酸1.5%+蔗糖0.58%）效果较好；因素B（氮源）中，水平1（酵母膏4.4%）效果较好；因素C（矿物元素）中，水平2（CaCO30.5%）效果较好；因素D（玉米浆）中，水平3（添加1.5%）效果较好，故最佳培养基组合为A3B1C2D3，即培养基配方为：乳酸1.5%，蔗糖0.58%，酵母膏4.4%，CaCO30.5%，玉米浆1.5%。

丙酸菌利用单一糖类作为碳源菌体生长缓慢，混合底物发酵的研究显示，当乳酸与其它碳源混合发酵时，丙酸菌优先利用乳酸，故在设计本实验时就选择了以乳酸为基础配合其它碳源的混合碳源发酵，因此碳源因素对固定化丙酸菌Pf 007的菌体生长影响不大。

氮源的种类与浓度对丙酸菌的生长有重要的影响，蛋白胨、酵母膏等均可作为丙酸菌的较好的氮源，但对无机氮源的研究应用比较少，本实验结果显示，酵母膏是固定化丙酸菌Pf 007较好的氮源。

据报道 Co2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+等二价离子对丙酸菌的生长均有积极的作用。本实验结果显示CaCO3是较好的矿物元素添加剂，不仅能补充丙酸菌生长所需的Ca2+，还能缓冲由于产酸形成的pH值剧降，从而有效的减缓由发酵液产酸对固定化丙酸菌Pf 007菌体生长的抑制。

玉米浆价格低廉，在工业化生产中，它不仅能作为氮源还能提供多种生长因子，因此在本实验中添加了部分玉米浆，更有利于固定化丙酸菌Pf 007的菌体生长。

2.2 增菌培养条件优化

采用2.1节实验中确定的最佳培养基组合，根据方法1.5进行正交实验，结果如表5和表6。

表5 正交实验结果及极差分析

表6 正交实验方差分析

从表5和表6中可以看出，每个因素对菌种增菌都有很大的影响，影响因素主次顺序是A＞D＞B＞C，即影响特别显著的是装液量，其次是发酵温度，再次是接种量，而影响最小的是初始pH值。选取最好水平组合，因素A（装液量）中，水平1（25 ml）效果较好；因素B（接种量）中，水平2（3%）效果较好；因素C（初始pH值）中，水平3（7.6）效果较好；因素D（发酵温度）中，水平3（35℃）效果较好，故最佳培养条件为A1B2C3D3，即装液量为250 ml三角瓶装液25 ml，3%接种量，培养基初始pH值7.6，发酵温度35℃。

摇瓶发酵所需要的氧是由表面通气供给的，通气状况是由装液量和摇床转速决定的。装液量过多会导致供氧不足，而过少的装液量则不利于菌体的生长。本试验是通过装液量的不同间接控制菌种发酵的通氧量，从而控制菌种的生长。结果显示，装液量对固定化丙酸菌Pf 007的菌体浓度有极为显著影响，装液量越少，即通氧量越大，菌体生长越旺盛；而温度是影响固定化丙酸菌Pf 007菌体浓度的另一个显著因素，温度越高，菌体生长速度越快，发酵周期越短，但温度过高也会给实际生产应用带来很多问题；接种量是影响固定化丙酸菌Pf 007菌体浓度的另一重要因素，接种量过少，则菌体延滞期和对数生长期延长，使发酵周期延长；反之，接种量过大，虽然可使菌体快速进入对数生长期，但过量的菌体会导致营养物质迅速消耗而阻碍菌体数量的增加。本实验中培养基的初始pH值对固定化丙酸菌Pf 007菌体浓度影响不大，说明此突变株对此条件不敏感。