生淀粉酶产生菌产酶条件与酶学性质的研究

卢福芝 覃巧艳 黄燕红 黄兰清

（河池学院化学与生命科学系，广西宜州 546300）

淀粉酶属于水解酶类，是催化淀粉、糖元和糊精中糖苷键的一类酶的统称。淀粉酶是最早用于工业化生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸[1]、印染[2-3]、酿造[4-7]、果汁和食品加工[8-12]、医药、洗涤剂[13]、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂[14-17]等多种领域。在酿造发酵工业、如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值，如添加α-高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温α-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等[4-6]。

生淀粉酶是能够直接水解不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒的一类酶[18]。包括α-淀粉酶（α-amylase,EC3.2.1.1）、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等酶类中能与生淀粉相互作用的成分，其中尤以α-淀粉酶最为常用[19-21]。α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物中[22-23]。

近年来，石油的价格不断增长，寻求一种高效的、可再生的能源来取代石油这一高耗费的能源，成为各国政府和实验室研究的热点。而现在大力发展发酵燃料乙醇也是各个国家的技术重点，例如利用木薯及马铃薯淀粉等来生产燃料乙醇。随着经济的发展，我国的石油缺口越来越大。推广使用燃料乙醇不仅能够缓解石油紧缺的情况，而且能够有效地解决木薯、稻谷等农作物的生物转换，推进农业生产的良性循环[24]。广西盛产木薯，木薯中淀粉含量高且利用效率高[25]，鉴于生淀粉的水解速度远远低于糊化淀粉[24]，若能研究并充分利用生淀粉酶的性质，将为社会带来巨大的科研和经济效应。

1 实验材料

1.1 材料来源

广西宜州市矮山大米厂附近采集的土壤样品。

1.2 主要试剂

木薯粉、大米粉、玉米粉为市售物品，其余试剂为生化分析纯。

1.3 培养基和培养条件

富集及分离培养基（g/l）蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5、生淀粉10。LB培养基（g/l）：蛋白胨10、酵母浸提物5、NaCl 10、pH值7.0，配置固体培养基时，需要加入2%琼脂。种子培养基（g/l）：葡萄糖8、蔗糖8、蛋白胨15、酵母膏3、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.6，pH值自然。发酵培养基（g/l）：蛋白胨 15、酵母膏 3、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.6，木薯生粉1%。其中木薯生粉过80目筛，160℃干热灭菌2 h，其余成分用湿热灭菌115 MPa，121 ℃、20 min。

2 实验方法

2.1 菌株的分离筛选

2.1.1 初筛

称取1 g土壤样品于三角瓶中，加入10 ml的无菌水中搅拌均匀静置，取1 ml上清液至100 ml富集培养基中，35℃、200 r/min进行富集培养2～3 d。取富集培养后的菌液在无菌的条件下，用无菌水进行浓度梯度稀释，取稀释度10-5、10-6、10-7菌液各150 μl涂布于分离培养基平板上，35℃下恒温培养箱培养3～5 d。

2.1.2 复筛

将初筛中透明圈与菌落直径比值较大的菌株接种于5 ml种子培养基中35℃培养过夜。将过夜培养的菌液进行浓度梯度稀释后涂平板，35℃恒温培养3～5 d，待长出有透明圈的单菌落后，选取透明圈与菌落直径比值最大的菌株进行划线分离，至获得纯培养，作为实验的目标菌株，并进行菌种保藏。

2.2 酶活力测定

2.2.1 生淀粉酶活力的测定[24]

DNS溶液的配置：称取3，5-二硝基水杨酸6.5 g，加入少量蒸馏水溶解后，加入2 mol/l NaOH溶液260 ml，再加入到含有185 g酒石酸钾钠的溶液中，最后加入2.5 g无水亚硝酸钠和2.5 g结晶酚，充分溶解后，定容至1 000 ml，装于棕色瓶中，室温放置一星期后使用。

用0.2 M Na2HPO4、0.1 M柠檬酸缓冲液（pH值7.0）配制1%的木薯生淀粉悬液为底物。先加入4 ml底物，50℃预热10 min后，再加入l ml酶液，在恒温振荡器中50℃、180 r/min反应30 min后，加入0.5 ml 4%的NaOH溶液终止反应。取适当体积的反应液于12 000 r/min离心10 min，上清液用DNS法测定还原糖的量。

酶活力单位的定义：上述分析的测定条件下，l min水解木薯生淀粉产生1 μg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量。

2.3 葡萄糖标准曲线

2.3.1 葡萄糖标准溶液的配置

将分析纯的葡萄糖在干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100 mg于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入l00 ml容量瓶中用蒸馏水定容至l00 ml，即配制成浓度为1 mg/ml的葡萄糖糖标准液。

2.3.2 葡萄糖标准曲线的测定

取11支试管，按照表1加入葡萄糖标准溶液配制出不同浓度的葡萄糖溶液，然后向各试管中加入4 000 μl DNS溶液，充分摇匀，沸水5 min，立即用冷水冷却至室温，以1号管作为空白对照，在540 nm测定光密度[24]。以光密度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制出葡萄糖标准曲线，如图1。

表1 葡萄糖标准曲线的制作

2.4 发酵产酶条件的研究[26]

2.4.1 不同底物对产酶的影响

取活化后目的菌株，分别以1%大米粉、1%木薯粉、1%玉米粉作为唯一碳源，35℃、200 r/min进行发酵，4 d后将培养液离心，测定上清液酶活，以确定最佳碳源。

2.4.2 温度对产酶的影响

将活化后的目的菌株，接种至发酵培养基中，分别在25、30、35、40 ℃，200 r/min进行发酵培养4 d后离心取上清液，测定其酶活，以确定最佳发酵温度。

2.4.3 接种量和发酵时间对产酶的影响

将目的菌株进行活化后，分别以3%、5%、8%的接种量进行35℃、200 r/min发酵培养，分别测定2、3、4、5、6 d发酵上清液的酶活力。

2.5 酶学性质的研究

2.5.1 温度对酶活力的影响

以0.2 M Na2HPO4、0.1 M柠檬酸缓冲液（pH值7.0）配置的1%木薯生淀粉溶液为底物，在30、40、45、50、60℃下反应30 min后分别测定生淀粉酶活力，确定该酶的最适反应温度。以最高酶活为100%，其余酶活与之相比计算相对酶活。

为确定该酶的热稳定性，将酶液在不同的温度下放置30 min后冰浴冷却，测定酶活力，以未保温的酶活力为100%。

2.5.2 pH值对酶活力的影响

将pH值分别为4、5、6、7、8的0.2 M Na2HPO4、0.1 M柠檬酸缓冲液配置的1%木薯生淀粉溶液为底物，与酶液反应30 min后测定酶活力。以最高酶活力为100%，其余酶活力与之相比计算相对酶活力。

为确定该酶的pH值稳定性，室温下把酶液分别放置在pH值为4、5、6、7、8的缓冲液30 min后测定酶活力，以未保温的酶活力为100%。

2.5.3 离子与酶活力

分别在试管中加入终浓度为5 mM Zn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Ni2+、Mn2+、Co2+离子，与酶液混合室温放置1 h后测生淀粉酶活力。以未加离子条件下测定的酶活力为100%，其余酶活力与之相比计算相对酶活力，测定离子对酶活力的影响。

3 结果与分析

3.1 菌株筛选

通过对采集样品进行多次富集培养，初筛及复筛后分离出一株产生淀粉酶活力较高的菌株，其在筛选平板上的生长情况如图2所示。

3.2 产酶条件的研究

3.2.1 不同底物对产酶的影响

分别以1%大米粉、1%木薯粉、1%玉米粉作为唯一碳源35℃、200 r/min进行发酵测定上清液酶活力，结果如表2。由表2可知，以1%木薯粉作为底物效果较好，产酶活力最高。

3.2.2 发酵温度对产酶的影响

将目的菌株分别在不同温度200 r/min条件下进行发酵培养4 d后离心取上清液，测定结果如图3。结果发现在35℃下培养效果最好。超过35℃后，酶活力迅速下降。

3.2.3 接种量和发酵时间对产酶的影响

将目的菌株进行活化，分别取3%、5%、8%的接种量进行35 ℃、200 r/min发酵培养，分别测定2、3、4、5、6 d的发酵上清液的酶活。结果如图4。结果发现以接种量为8%并发酵4 d的效果较好，酶活力最高。

表2 底物对产酶的影响

3.3 酶学性质的研究

3.3.1 最适温度与稳定性

分别在30、40、50、60℃下测定生淀粉酶的酶活力，结果如图5所示，该酶的最适温度为50℃。

生淀粉酶酶液在30、40、50、60 ℃保温30 min后测定剩余酶活力，结果如图6所示，在温度30℃至50℃时，剩余酶活力保持在80%以上，即在此范围时酶是稳定的，而当温度高于50℃时，酶活力迅速下降。

3.3.2 最适pH值与稳定性

分别用pH值4.0至8.0的缓冲液配制质量分数为1%的木薯生淀粉底物，测定菌株生淀粉酶酶活力，结果如图7所示。由图可知该酶的最适pH值7.0。当pH值大于7时，酶活力迅速下降。

室温下将酶液在不同pH值缓冲液中放置30 min后测定剩余酶活力。结果如图8所示。由图可知在pH值6至8时，该酶有80%以上的剩余酶活力，表明其在该范围内较稳定。

3.3.3 离子对酶活力的影响

将终浓度为5 mmol/l的金属离子与酶液作用l h后，测定相对酶活力，以未加离子条件下测定的酶活力为100%，结果如图9。由图9可知，Ca2+、Mg2+对该酶具有一定的激活作用，其中Ca2+的激活效果较强；金属离子Zn2+、Ni2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Co2+对该酶具有抑制作用，其中Cu2+、Fe2+、Mn2+抑制作用较强。

4 结 论

从宜州市大米厂附近采集的样品中，筛选出一株水解生淀粉能力较强的芽孢杆菌，测定其发酵后粗酶液的酶活达92 U/ml，该酶最适pH值为7.0，最适温度为50℃。金属离子Ca2+、Mg2+对酶有激活作用，金属离子Zn2+、Ni2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Co2+对酶有不同程度的抑制作用。生淀粉酶可以将传统工艺中淀粉糊化、液化、糖化合并为一步进行，有效缩减了生产成本[27]。目前生产中应用的生淀粉酶主要来自于真菌，且由于各种条的件限制，尚未得以广泛应用[18]。本文筛选的芽孢杆菌产生的生淀粉酶具较好的热稳定性和较宽pH范围，因而有较好的工业应用前景。后期研究中将利用基因工程等手段对该菌株进行改造，进一步提高产酶能力及优化其酶学特性。