白念珠菌对人THP-1细胞产生白细胞介素6、活化信号分子IκBα的影响

杨海平 杜蕾蕾 曾荣 段志敏 沈永年 胡素泉 刘维达 陈青 李岷

白念珠菌对人THP-1细胞产生白细胞介素6、活化信号分子IκBα的影响

杨海平 杜蕾蕾 曾荣 段志敏 沈永年 胡素泉 刘维达 陈青 李岷

目的探讨白念珠菌对人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞系）分泌白细胞介素6（IL-6）和细胞内信号分子NF-κB抑制蛋白（IκBα）激活的影响。方法实时荧光定量PCR分析105、106CFU/ml灭活白念珠菌刺激THP-1细胞IL-6 mRNA表达水平变化，酶联免疫吸附法检测IL-6分泌量。免疫印迹法分析白念珠菌体外作用THP-1细胞后不同时间IκBα和磷酸化IκBα的水平。结果105CFU/ml白念珠菌刺激THP-1 细胞后 1、3、6 h，IL-6 mRNA 水平（2-ΔΔCt）分别为 1.48 ± 0.06、6.48 ± 0.30、125.34 ± 1.47，刺激 3 h、6 h 后明显高于空白对照组（P＜0.001）。106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后1、3、6 h，IL-6 mRNA水平分别为2.96± 0.35、8.57± 1.27、588.10± 2.31，与空白对照组比较，P值分别为0.036、0.001、 ＜ 0.001。106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后24 h，IL-6蛋白水平为（924.9±30.13）ng/L，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。106CFU/ml白念珠菌作用THP-1细胞后30 min、60 min,磷酸化IκBα蛋白水平显著升高，而IκBα蛋白水平相应降低。结论人THP-1细胞体外与白念珠菌作用后激活信号分子NF-κB并分泌IL-6，参与抗念珠菌感染固有免疫反应。

念珠菌，白色；白血病，单核细胞，急性；白细胞介素6；I-κB蛋白质类；NF-κB

白念珠菌是引起浅部、深部念珠菌病的最常见病原真菌。侵袭性念珠菌病是院内真菌感染最主要的死因，而白念珠菌是最常见的致病念

珠菌［1］。宿主单核巨噬细胞作为固有免疫中重要反应细胞，能识别并清除入侵的白念珠菌［2］。本研究旨在探讨白念珠菌能否激活人急性单核细胞白血病细胞系细胞（THP-1）的信号分子 NF-κB抑制蛋白（IκBα），诱导白细胞介素6（IL-6）的分泌。

材料和方法

1.细胞、菌株、主要试剂：白念珠菌由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心提供，56℃30 min水浴灭活后，配制成不同浓度菌悬液待用。人THP-1细胞株购自美国American Type Culture Collection（ATCC）。兔抗人 IκBα 和磷酸化 IκBα 抗体为美国Cell Signaling Technology公司产品。IL-6酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒为欣博盛公司产品。PrimeScript RT Master Mix逆转录酶试剂盒为日本TaKaRa公司产品。iTaq Universal SYBR Green Supermix为美国Bio-rad公司产品。巴豆酯（PMA）、脂多糖（LPS）为美国Sigma公司产品。

2.细胞培养：人THP-1细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养、传代。将细胞制备成105/ml细胞悬液，接种于12孔细胞培养板每孔1 ml及6孔细胞培养板每孔2 ml，加入100 μg/L PMA刺激48 h后，予不同浓度白念珠菌共培养。

3.实时荧光定量逆转录PCR：终浓度为105CFU/ml和106CFU/ml白念珠菌与2×105/ml THP-1共孵育，并设阳性刺激物 LPS（100 μg/L）组、培养基空白对照组。TRIzol法抽提总RNA，按PrimeScript RT Master Mix逆转录酶试剂盒说明书将1 μg总RNA反转录为cDNA。使用ABI 7300 PCR仪，采用Syber green法对目的基因进行扩增。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的变化水平，ΔCt=目的基因-内参照（β肌动蛋白）；某一样品的ΔΔCt=某一样品ΔCt-对照组样品的ΔCt。相关基因引物见表1。

4.Western印迹分析：白念珠菌悬液（106CFU/ml）作用的THP-1细胞，裂解细胞，提取总蛋白。等量蛋白的不同样品梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至聚偏二氟乙烯膜上。5%BSA封闭2 h，兔抗人单克隆抗体4℃孵育过夜。TBST液洗膜3次后，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG第二抗体反应2 h，TBST液洗膜3次，Supersignal试剂显色发光，检测IκBα和磷酸化IκBα的水平。

表1 实验所用引物序列

表2 白念珠菌对人THP-1细胞株白细胞介素6 mRNA水平的影响

5.ELISA法：刺激THP-1细胞后24 h，收集上清液，按照试剂盒说明书检测IL-6含量。

结 果

1.白念珠菌对IL-6 mRNA水平的影响：刺激后1、3和6 h，不同浓度白念珠菌组、LPS组、空白对照组的IL-6 mRNA水平的变化情况的见表2。105CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后3、6 h，IL-6 mRNA水平明显高于空白对照组（P＜0.001）。106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后1、3、6 h，IL-6 mRNA水平与空白对照组比较，P值分别为0.036、0.001、＜0.001。

2.白念珠菌对IL-6蛋白分泌的影响：根据实时定量PCR结果，选取白念珠菌刺激效果较好的浓度106CFU/ml刺激后24 h，白念珠菌组、LPS组、空白对照组的上清液中IL-6浓度的分别为（924.90±30.13）、（286.10± 6.12）、（10.47±0.07）ng/L， 白念珠菌组与空白对照组比较差异有统计学意义（均P＜0.01）。

图1 免疫印迹法分析白念珠菌体外作用THP-1细胞后不同时间IκBα和磷酸化IκBα的水平 1：空白对照组；2：作用30 min；3：作用 60 min

3.白念珠菌对THP-1细胞IκBα激活的影响：刺激后30 min，磷酸化IκBα蛋白水平已有升高，60 min时磷酸化IκBα蛋白水平显著升高；IκBα蛋白水平则相应有所降低。提示白念珠菌能够激活THP-1细胞信号分子IκBα。见图1。

讨 论

固有免疫反应在抗白念珠菌感染中发挥重要作用，中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞作为主要的固有免疫细胞，构成抗感染免疫反应的第一道防线［3-4］。IL-6为主要的前炎症因子之一，可由单核细胞、巨噬细胞等多种骨髓来源的免疫细胞以及各种上皮细胞、血管内皮细胞分泌，在抗感染炎症反应的早期阶段通过诱导产生急性时相反应蛋白来发挥重要作用；在炎症后期，可招募单核、巨噬细胞聚集至感染局部，并能促进中性粒细胞凋亡以避免其过度分泌各种活性酶导致的组织损伤［5-7］。

早期研究发现，与正常小鼠相比，IL-6基因缺陷小鼠对系统性或经消化道感染的白念珠菌更为敏感，中性粒细胞数量远低于正常小鼠，感染后其数量也未增多。IL-6缺失会引起念珠菌感染小鼠出现先天性防御反应缺陷，如中性粒细胞功能减低以及产生IL-10对巨噬细胞活性的抑制效应，这一系列反应最终导致IL-6缺陷小鼠不能产生Th1型保护反应，出现以IL-10高表达为特征的Th2型损伤性免疫反应［8］。

本研究初步发现，105、106CFU/ml白念珠菌作用THP-1细胞后，上调IL-6 mRNA水平均出现时间依赖效应，在刺激后3 h出现上升，刺激后6 h，105CFU/ml白念珠菌组mRNA水平为3 h的19倍，106CFU/ml组则升高59倍。本研究采用LPS（TLR4受体的配体）作为激活THP-1细胞的阳性对照物，也能诱导出相同的时间依赖效应，刺激6 h后IL-6 mRNA水平比3 h组上升77倍。

刺激后3 h，105CFU/ml组IL-6 mRNA水平为6.48± 0.30，106CFU/ml组为 8.57± 1.27，后者为前者的1.32倍。刺激后6 h，两组分别为125.34±1.47和588.10±2.31，高浓度白念组为低浓度组的4.7倍，提示白念珠菌上调IL-6 mRNA水平为剂量依赖效应。

本研究结果表明，106CFU/ml作用THP-1细胞24 h后，上清液中IL-6含量为（924.90±30.13）ng/L，与空白对照组（10.47±0.07 ng/L）比较，明显上升，表明白念珠菌不仅能在mRNA水平诱导THP-1细胞上调IL-6转录，而且在蛋白水平增强该因子的分泌。

NF-κB作为一种转录因子在调控前炎症因子转录表达中起重要作用，在无外界刺激因素时，该因子主要由p50和p65亚单位组成，与NF-κB抑制蛋白（IκBα）结合成复合体，在细胞质中处于失活状态。当细胞接受适宜刺激后，IκB激酶复合体可使IκBα 磷酸化和降解， 导致 NF-κB p50、p65二聚体与IκBα解离，该二聚体随后移位入核，结合到NF-κB特异的DNA结合位点，从而调控相应的基因转录表达［9-10］。本实验结果表明，白念珠菌刺激后30 min已出现IκBα蛋白磷酸化，60 min时IκBα磷酸化水平显著升高，而对应的IκBα水平有所降低，提示白念珠菌可诱导THP-1细胞中作为NF-κB p50、p65二聚体抑制剂的IκBα分子出现活化，其对NF-κB抑制效应随之降低，最终导致后者移位入核，调节IL-6等前炎症因子的转录。

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2014-01-26）

（本文编辑：颜艳）

Effect ofCandida albicanson the production of interleukin-6 by and activation of IκBα in human THP-1 monocytes

Yang Haiping*,Du Leilei,Zeng Rong,Duan Zhimin,Shen Yongnian,Hu Suquan,Liu Weida,Chen Qing,Li Min.*454th Hospital of PLA,Nanjing 210002,China

s；Li Min,Email；drlimin@sina.cn；Chen Qing, Email；qngchen@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect ofCandida albicanson the production of interleukin-6 by and activation of IκBα in an acute monocytic leukemia cell line THP-1.MethodsTHP-1 cells were classified into three groups to be stimulated by heat-killedC.albicanscells in concentrations of 105and 106colony-forming units（CFU）/ml and lipopolysaccharide （100 μg/L） in vitrorespectively.Those remaining untreated served as the blank control group.After additional culture for different durations,real time reverse transcription PCR and enzyme-linked immunosorbent assay were performed to measure the mRNA and protein expression levels of interleukin-6（IL-6）respectively,and Western blot was conducted to determine the levels of total and phosphorylated IκBα.Statistical analysis was carried out byttest.ResultsA significant increase was observed in the mRNA expression level（2-ΔΔCt）of IL-6 in THP-1 cells at 3 and 6 hours after starting treatment withC.albicansat 105CFU/ml（6.48±0.30 vs.0.84±0.16,125.34±1.47 vs.1.22±0.22,bothP＜0.01）,and at 1,3 and 6 hours after starting treatment withC.albicans at 106CFU/ml（2.96±0.35 vs.1.03±0.16,8.57±1.27 vs.0.84±0.16,588.10±2.31 vs.1.22±0.22,P＜0.05 or 0.01）compared with the blank control group,but no significant difference was noted between THP-1 cells at 1 hour after starting treatment withC.albicansat 105CFU/ml and those remaining untreated（1.48±0.06 vs.1.03±0.16,P ＞ 0.05）.The protein expression level of IL-6 was （924.9 ± 30.13） ng/L in THP-1 cells at 24 hours after starting treatment withC.albicansat 106CFU/ml,significantly different from that in the blank control group（P＜0.001）.There was a marked elevation in the level of phosphorylated IκBα protein,but an obvious reduction in the level of IκBα protein in THP-1 cells treated withC.albicansat 106CFU/ml for 30 and 60 minutes.ConclusionHuman THP-1 monocytes may play a role in innate immune responses againstC.albicansthrough activation of nuclear factor-κB and production of IL-6.

Candida albicans；Leukemia,monocytic,acute；Interleukin-6；I-kappa B proteins；NF-kappa B

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.010

国家自然科学基金（81371750、81101734）；江苏省自然科学基金（BK2011128）

210002南京，解放军454医院（杨海平）；中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所、江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室（杜蕾蕾、曾荣、段志敏、沈永年、胡素泉、刘维达、李岷）；江苏省血液中心（陈青）

李岷，Email：drlimin@sina.cn；陈青，Email：qngchen@hotmail.com