反常性痤疮一家系临床表型及基因突变研究

焦婷 韩长元 张力 冯燕娜 王金燕

反常性痤疮一家系临床表型及基因突变研究

焦婷 韩长元 张力 冯燕娜 王金燕

目的研究1个反常性痤疮患者家系的基因突变。方法对一确诊的反常性痤疮先证者家系进行现场调查，并采集外周血标本。PCR扩增早老素1（PSEN1）、单过性跨膜蛋白（NCSTN）和早老素增强子2（PSENEN）的所有外显子，PCR产物进行序列分析。结果该家系共有5代67人，其中25人患病（男13例，女12例），符合常染色体显性遗传。家系中患者皮损主要分布于颈背部、胸部和臀部，腋下很少或未被累及。家系中11例患者NCSTN基因第11号外显子存在c.1258C＞T错义突变，导致第420位由氨基酸谷氨酰胺变为终止密码子。同时检测家系中6例无反常性痤疮的正常人及与该家系无关的100名健康对照者，未发现该突变。检索美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站单核苷酸多态性（SNP）数据库，未发现该突变。结论该反常性痤疮家系存在一个新的错义突变，即NCSTN基因11号外显子c.1258C＞T，这可能是该家系患者发病的分子基础。

反常性痤疮；表型；突变

反常性痤疮（acne inversa，AI）是一种以反复发生皮肤脓肿、窦道及瘢痕形成为特征的慢性化脓性皮肤炎症，皮损多发生在大汗腺分布的皮肤皱褶部位，如腋窝、腹股沟、会阴部等［1-3］。家族性 AI属于常染色体显性遗传病（OMIM142690）。近年来，多个研究小组对该症进行了系列遗传学研究，确定其发病与编码γ-分泌酶的基因突变有关［4-10］。本研究在此基础上，对一个大的AI家系进行突变位点检测。

一、对象

对浙江省一AI家系进行现场调查，在获得所有受试者知情同意后，进行详细的皮肤科检查。采集家系中11例患者和6例健康人血样或口腔黏膜标本，另选与该家系无关的100例健康人作为对照。本研究经宁波市第二医院伦理委员会批准。

二、方法

1.外周血基因组DNA提取：抽取该家系中11例患者、6例健康人及与该家系无关的100例健康人外周血5 ml，2%EDTA抗凝，-70℃冷冻。采用全血基因组DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）提取外周血DNA。取部分患者口腔黏膜拭子提取DNA。

2.PCR 扩增：根据文献［4］，合成早老素 1（PSEN1）、单过性跨膜蛋白（NCSTN）和早老素增强子2（PSENEN）的引物，其中第11外显子引物序列：上游5′-AGGAAATTCAGAGAGCC TTGGT-3′,下游 3′-CTGAAGTTCTGGAGGGGGTAGT-5′。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系总体积 25 μl，反应液成分包括 14.8 μl缓冲液，dNTP 5 μl，上下游引物各1.0 μl，Taq酶0.2 μl（1 U），基因组DNA 1.0 μl，反应条件为94℃预变性2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃1 min，共30个循环，72℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

3.DNA测序与分析：所有PCR产物经纯化后采用ABI3730全自动DNA测序仪（美国Applied Biosystems公司）进行序列测定，各测序结果采用BLAST软件进行同源性分析。

三、结果

1.家系调查和临床表现：鉴定了一个5代67人中国汉族人AI家系（图1），家系中25例患者（男13例，女12例），符合常染色体显性遗传。检测对象包括该家系11例患者和6例健康人。先证者，男，44岁，自14岁开始，颈后、背部及臀部出现多个红色丘疹、结节，伴疼痛，此后皮损逐渐变软，自行破溃溢脓，愈后留有凹陷性瘢痕、囊肿和脓肿，30年来皮损反复发生，逐渐增多增大，部分融合成不规则形巨大斑块，以左侧臀部为著，腋下及腹股沟散在个别暗红色炎性丘疹、结节（图2）。家族中其余24例患者有类似症状，均在青春期发病，症状均较先证者轻，皮损主要累及臀部及颈背部，腋下及腹股沟均未累及。

2.突变分析：对家系中11例患者、6例健康人及与该家系无血缘关系的100例健康人的NCSTN、PSEN和PSENEN所有外显子采用PCR扩增，11例患者的NCSTN基因第11号外显子存在c.1258C＞T（p.Q420X）错义突变（图3）。所有突变均经正向和反向测序证实。而家系中的6例健康人及100例健康对照的DNA测序结果未发现此突变。查询美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站单核苷酸多态性（SNP）数据库，未发现该突变。

四、讨论

AI亦称为毛囊闭塞三联征，是指聚合性痤疮、化脓性汗腺炎、穿掘脓肿性头部毛囊周围炎同时存在。AI病变主要累及腋下、腹股沟、外生殖器区及肛周等毛囊皮脂腺单位、顶泌汗腺分布丰富的部位。有文献［4］报道，NCSTN基因突变的患者，以面部、前额、颈背部、胸部、臀部和腰部等非典型部位的病变为主，而腋下的病变相对较轻。本研究中该家系患者的皮损分布特征与该文献报道的一致，患者皮损主要分布于颈背部、胸部和臀部，腋下未被累及。

图1 反常性痤疮患者家系图 箭头所指为先证者

图2 先证者（Ⅲ-23）臀部皮损

图3 反常性痤疮患者（3a）及家系内健康人（3b）NCSTN基因第11外显子测序结果（箭头示突变位置）

AI的确切病因及发病机制尚不十分清楚，认为是毛囊闭锁、遗传因素、激素水平变化及外因刺激等多种因素共同作用引起的疾病［11］。王宝玺等［4］研究表明，编码 γ 分泌酶亚单位的PSEN1、NCSTN和PSENEN 3个基因发生突变，都会导致家族性反常性痤疮。我们对1个AI家系5代中11例患者的NCSTN、PSEN和PSENEN所有外显子进行测序，发现NCSTN基因第11号外显子存在c.1258C＞T（p.Q420X）错义突变，该家系中的6例健康人及与该家系无关的100例健康人DNA混合液PCR产物测序，未发现此突变。查询美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站单核苷酸多态性（SNP）数据库，未发现该突变。因此认为，我们发现的是一个新的致病突变，该突变导致NCSTN的第420位密码子由CAG变成TAG，氨基酸由谷氨酰胺变为终止密码子，所编码的蛋白将提前终止（全长709个氨基酸），进而可能影响γ分泌酶功能。

γ分泌酶是由NCSTN、PSEN、APH1和PSENEN 4种蛋白亚基构成的蛋白复合体，能切割各种Ⅰ型蛋白酶,包括Notch信号通路的受体及与阿尔采默病密切相关的淀粉样前蛋白［12］。NCSTN编码一有高度糖基化胞外结构域的Ⅰ型跨膜蛋白，由709个氨基酸组成，Asn263-Ala483区域是其活性中心，对γ分泌酶的组装及其功能的发挥起着重要作用［13］。动物模型研究发现，小鼠皮肤γ分泌酶灭活后，会影响Notch信号通路，引发毛囊过度角化，出现与反常性痤疮患者病变皮肤相似的组织病理改变［14］。本研究中，我们发现NCSTN的c.1258C＞T（p.Q420X）错义突变，导致第420位由氨基酸谷氨酰胺变为终止密码子。在第420个氨基酸提前出现的终止密码子将导致NCSTN的胞内结构域与胞外结构域断裂，被截短的蛋白其功能必然会受到影响。因此，这可能是该家系患者发病的分子基础。本研究中，NCSTN基因突变的患者，以面部、颈背和臀部等非典型部位的病变为主，而腋下的病变相对较轻。这一发现目前仅在王宝玺等的研究及本研究中有报道，还需要更多的家系研究进一步证实。

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2014-03-19）

（本文编辑：颜艳）

Clinical and genetic analysis of a pedigree with acne inversa

Jiao Ting,Han Changyuan,Zhang Li,Feng Yanna,Wang Jinyan.Department of Dermatology,Ningbo No.2 Hospital,Ningbo 315010,Zhejiang,China

；Wang Jinyan,Email；nbwangjinyan@126.com

ObjectiveTo detect γ-secretase gene mutations in a large Chinese pedigree with acne inversa（AI）.MethodsClinical evaluation was carried out in a large pedigree with AI through field investigation. Peripheral blood samples were obtained from 17 family members（11 affected and 6 unaffected）and 100 unrelated healthy human controls.DNA was extracted from the blood samples,and PCR was performed to amplify all the coding regions of PSEN 1,PSENEN and NCSTN genes followed by DNA sequencing analysis.ResultsThere were 67 members over 5 generations in this family,of whom,25（13 males and 12 females） were affected by AI.AI was inherited in an autosomal dominant manner in this family.Skin lesions were mainly distributed on the neck,back,chest and buttocks,and occasionally in subaxillary regions.DNA sequencing revealed a novel missense mutation,c.1258C＞ T （p.Q420XP）,in the exon 11 of the NCSTN gene in 11 affected family members,which leads to a substitution of glutamine by a premature termination codon at amino acid 420 （p.Q420X）.The mutation was undetected in either the unaffected members or the unrelated healthy controls,and had not been registered in the single nucleotide polymorphism （SNP） database in National Center for Biotechnology Information.ConclusionsThere is a novel heterozygous missense mutation，c.1258C ＞ T in the exon 11 of the NCSTN gene，which may be the molecular basis of pathogenesis of AI in this family.

Acne inversa；Phenotype；Mutations

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.015

宁波市2013年度第二批科技项目（2013A610268）

315010浙江，宁波市第二医院皮肤科

王金燕，Email：nbwangjinyan@126.com