银屑病患者皮肤中原位记忆T淋巴细胞的检测

栾超 杨永红 王焱 刘毅 陈敏 蒋明军 王宝玺

银屑病患者皮肤中原位记忆T淋巴细胞的检测

栾超 杨永红 王焱 刘毅 陈敏 蒋明军 王宝玺

目的研究皮肤组织原位记忆T淋巴细胞在银屑病发病过程中的作用。方法收集32例进行期斑块状银屑病患者的临床资料，采集每例患者的皮损和非皮损组织、9例患者皮损消退后皮肤标本；10例健康人皮肤为对照。采用免疫组化法检测组织原位记忆T淋巴细胞的特征性表面标志CD69和CD103，分析组织原位记忆T淋巴细胞在银屑病发病不同时期的情况。两组免疫组化结果进行t检验。结果32例进行期银屑病患者皮损和非皮损每高倍视野中CD69+CD103+T淋巴细胞数量分别为11.34±7.60和2.72±4.20，皮损区明显高于非皮损区（t=8.46，P＜0.01）；其中9例患者皮损消退前后每高倍视野中CD69+CD103+T淋巴细胞数量分别为14.33±2.21和12.00±4.58，皮损消退前后比较差异无统计学意义（t=1.98，P=0.08）；健康对照组为1.70±2.98，与银屑病患者非皮损区比较，差异无统计学意义（t=0.71，P＞0.05）。结论银屑病患者皮肤中原位记忆T淋巴细胞可能在皮损的形成和复发过程中起作用。

银屑病；记忆T淋巴细胞，原位

最近有研究发现，病毒感染皮肤后，皮肤中停留少量的特殊记忆T淋巴细胞亚群，对同类病毒再次感染起防御作用，不同于中心记忆T淋巴细胞（TCM） 和效应记忆T淋巴细胞（TEM），这群CD69+CD103+T淋巴细胞被命名为组织原位记忆T淋巴细胞（TRM）［1-2］。TRM细胞是最近新发现的一群特殊的记忆T细胞，炎症结束后不会凋亡，能长期存活于周围组织中。TRM细胞分化更为完全，不依赖于循环记忆T细胞的补充，能够长期定居在周围组织中。TRM细胞的数量不随炎症细胞的增多而增加，在感染和肿瘤免疫中发挥重要作用［1-5］。银屑病是T淋巴细胞介导的慢性炎症性疾病，易于反复发作。有研究提示，患者皮肤居住细胞可能在该病反复发作过程中起重要作用［6-7］，但对其细胞类型和致病机制却知之甚少。随着近年来一些T淋巴细胞新亚群的发现，认识到记忆T淋巴细胞在该病复发过程中的作用［8-9］。我们推测TRM细胞可能在银屑病的发病机制，尤其在复发过程中起重要作用。本文运用免疫组化法检测了银屑病患者皮损、非皮损和消退后皮肤中TRM细胞的情况，研究TRM细胞在银屑病发病机制中的作用。

资料和方法

一、资料

1.标本：32例进行期斑块状银屑病患者来源于2013年9月至2014年1月我院门诊患者，经临床和组织病理确诊为银屑病，男19例，女13例，年龄19～56岁，病程1个月至20年，银屑病严重程度指数（PASI）3.8～46。皮肤钻孔法采集同一患者躯干部皮损区和非皮损区皮肤标本、9例皮损消退后皮肤标本。10例健康人对照皮肤来源于我院皮肤外科整形手术多余的躯干部正常皮肤，男6例，女4例，年龄18～49岁。银屑病患者和健康人对照组的性别比例和年龄差异无统计学意义。本研究经本院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

2.试剂：鼠抗人CD69单克隆抗体和兔抗人CD103单克隆抗体均由沙特阿拉伯Abcom公司生产，分别按1∶25和1∶500稀释，磷酸盐缓冲液（PBS）由美国Gibco公司生产。枸橼酸抗原修复缓冲液、内源性过氧化氢酶抑制剂、非免疫动物血清（羊）、HRP标记抗羊鼠IgG、HRP标记抗兔 IgG、DAB显色试剂盒、苏木素和中性树胶均由福州迈新生物技术有限公司生产。

二、方法

1.免疫组化：所有标本经甲醛液固定，将组织制成蜡块后连续切成5 μm薄片，免疫组化染色按照染色试剂盒操作说明进行，所有切片均在同一质控条件下进行，设阳性和阴性对照。其中，双染色为DAB与AEC染色，CD69使用DAB染色，阳性为棕色，CD103使用AEC染色，阳性为红色。

2.结果判定：CD69阳性表达定位于细胞膜，CD103阳性表达定位于细胞膜和胞质，单染结果均为棕黄色颗粒。在同一切片上CD69（棕色）和CD103（红色）同时染色，即同时表达CD69和CD103的T淋巴细胞见红棕色颗粒。计算5个显微镜高倍视野下阳性表达T淋巴细胞平均个数。

3.数据处理：采用SPSS13.0软件进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 银屑病皮损CD69和CD103连续切片同部位单染结果表皮和真皮均有CD69+T淋巴细胞和CD103+T淋巴细胞，见棕黄色颗粒（1a：CD69×100；1b：CD103×100）

图2 银屑病皮损CD69（棕色）和CD103（红色）双染色结果CD69+CD103+T淋巴细胞见红棕色颗粒（2a：×100；2b：×200）

结 果

32例银屑病患者皮损（图1）和非皮损、9例皮损消退后皮肤和10例正常人对照皮肤中均可见单独表达CD69和CD103的T淋巴细胞，分布较广泛，包括表皮和浅深层真皮。32例银屑病患者皮损中可见CD69+CD103+T淋巴细胞，分布于表皮和真皮浅层（图2）；9例皮损消退后皮肤中CD69+CD103+T淋巴细胞主要分布于表皮；仅有13例银屑病患者非皮损和3例健康人对照皮肤中见CD69+CD103+T淋巴细胞，分布于真皮浅层。

进行期银屑病患者皮损（32例）和非皮损（13例）每个显微镜高倍视野中CD69+CD103+T淋巴细胞数量分别为11.34±7.60和2.72±4.20，皮损明显高于非皮损（t=8.46，P＜ 0.01）；健康人对照皮肤（10例）为1.70±2.98，与32例银屑病非皮损比较，差异无统计学意义（t=0.71，P＞0.05）。银屑病患者PASI评分与皮损中CD69+CD103+T淋巴细胞数量正相关（r=0.75，P＜ 0.01）。

32例银屑病患者中的9例患者皮损消退前后每高倍视野中CD69+CD103+T淋巴细胞数量分别为14.33±2.21和12.00±4.58，皮损消退前后比较差异无统计学意义（t=1.98，P=0.08）。9例患者消退后皮肤中CD69+CD103+T淋巴细胞数量明显高于10例健康人对照皮肤（t=5.87，P＜0.01）。9例患者PASI评分与皮损消退后皮肤中CD69+CD103+T淋巴细胞数量正相关（r=0.89，P＜ 0.01）。

讨 论

普遍认为银屑病是多基因遗传背景下主要由Th17和Th1细胞介导的免疫异常性疾病，T淋巴细胞在该病发病机制中起中心作用。有研究［6-7］通过移植银屑病患者发病时非皮损处皮肤到特定小鼠建立模型，发现非皮损处皮肤仍能发展成银屑病皮损，提示银屑病患者皮肤中的居住细胞可能在该病发生过程中起着重要作用。

TRM细胞与TCM和TEM具有不同的表型和功能，在周围组织的定位需要组织局部微环境和黏附分子的参与。组织归巢T淋巴细胞表达归巢受体CCR9和α4β7整合素，当T淋巴细胞到达周围组织后CCL25和转化生长因子α（TGF-α）诱导归巢T淋巴细胞表达E链（CD103），与β7链重新整合，使T淋巴细胞在组织中定居［10］。此外，细胞因子可促进CD69表达缺失的T淋巴细胞迁移，CD69可使T淋巴细胞定位于局部组织［11-12］。CD69和CD103是TRM细胞的特征性表面标志。

银屑病皮损消退后是否有抗原特异性TRM继续停留？在该病复发过程中起何作用？我们的研究发现，银屑病患者皮损中CD69+CD103+T淋巴细胞的数量明显高于非皮损，表明 CD69+CD103+T淋巴细胞的数量与皮损的形成有关。易于反复发作是银屑病的特点，也是治疗难点，其机制目前还不清楚。本研究发现，银屑病患者皮损消退后表皮中仍然存在相当数量的CD69+CD103+T淋巴细胞，提示TRM细胞可能与该病皮损的复发有关。但本研究中银屑病患者皮损消退后皮损获得困难，样本量较小，需要扩大样本量研究。此外，本研究发现，银屑病非皮损处CD69+CD103+T细胞数量与健康人皮肤无明显差异，部分解释了外周循环来源的活化T细胞是否导致皮损还取决于皮肤中居住T细胞的分布情况。

由于通过免疫组化方法同时检测三种表面标记存在困难，本研究没有区别皮肤中的CD69+CD103+T淋巴细胞是属于CD4+T淋巴细胞还是CD8+T淋巴细胞亚群。有研究发现，银屑病患者临床痊愈后皮肤中主要是CD8+T淋巴细胞［13］，推测银屑病皮损消退后留下的主要是CD8+TRM细胞。近期的研究也发现，皮肤在HSV-1感染后留下的CD8+TRM细胞可以直接被再次感染的同类病毒抗原激活，TRM细胞活化阈值较低，其发挥免疫作用可以不需要CD4+T淋巴细胞和B细胞的参与［1］。因此，银屑病患者皮肤中的TRM细胞的种类、功能和活化机制还需要进一步深入研究。

志谢本院皮肤整形美容外科和门诊治疗室在标本收集过程中的大力支持

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2014-02-05）

（本文编辑：颜艳）

Detection of tissue-resident memory T lymphocytes in patients with psoriasis

Luan Chao,Yang Yonghong,Wang Yan,Liu Yi,Chen Min,Jiang Mingjun,Wang Baoxi.Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs；Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

；Chen Min,Email；drchenmin@126.com

ObjectiveTo investigate the role of tissue-resident memory T lymphocytes in the pathogenesis of psoriasis.MethodsClinical information was collected from 32 patients with progressive plaque psoriasis.Tissue specimens were obtained from both lesional and nonlesional psoriatic skin of all the patients,as well as from faded lesions in 9 of these patients.Tissue specimens from the normal skin of 10 healthy individuals served as the controls.Immunohistochemical staining was performed to detect the two characteristic surface markers CD69 and CD103 on tissue-resident memory T lymphocytes and to analyze the status of these T lymphocytes at different stages of psoriasis.The results of immunohistochemical staining were compared byttest.ResultsThe mean number of CD69+CD103+T lymphocytes per high-power field was significantly higher in lesional skin than in nonlesional skin of the 32 patients（11.34±7.60 vs.2.72±4.20,t =8.46,P＜0.01）,but similar between psoriatic lesions in the 9 patients before and after subsidence（14.33±2.21 vs.12.00±4.58,t =1.98,P=0.08）.There was no significant difference in the mean number of CD69+CD103+T lymphocytes between nonlesional psoriatic skin and normal control skin（2.72±4.20 vs.1.70±2.98,t =0.71,P＞0.05）.ConclusionTissue-resident memory T lymphocytes may play a role in the formation and recurrence of psoriatic lesions in patients.

Psoriasis；Memory T lymphocyte,resident

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.009

卫生公益性行业科研专项经费（201002016）

210042南京，中国医学科学院北京协和医学院皮肤病医院、江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室

陈敏，Email：drchenmin@126.com