斑秃患者外周血CD4+CD25+T细胞培养上清液白介素10和转化生长因子β1检测

马新华 邵文俊 金宛宛 高宇

斑秃患者外周血CD4+CD25+T细胞培养上清液白介素10和转化生长因子β1检测

马新华 邵文俊 金宛宛 高宇

目的探讨CD4+CD25+T细胞与斑秃发病之间的关系。方法收集了3组研究对象,其中健康对照组25例、稳定期斑秃患者25例、进展期斑秃患者23例。抽取所有对象外周血,提取CD4+CD25+T细胞,培养4 d,收集培养上清液,ELISA法检测上清液IL-10和TGF-β1水平。结果进展期斑秃患者外周血CD4+CD25+T细胞培养的IL-10和TGF-β1分别为(31.68±6.78)pg/ml和(32.29±6.80)pg/ml,明显低于健康对照组(57.34±14.15)pg/ml、(57.43±15.16)pg/ml和稳定期斑秃患者(52.56±13.02)pg/ml和(61.75±14.10)pg/ml(P＜0.05),而健康对照组和稳定期斑秃患者之间差异无统计学意义(P＞0.05)。结论CD4+CD25+T细胞分泌IL-10和TGF-β1功能降低,在斑秃发病中有一定意义。

斑秃;转化生长因子β1;白细胞介素10

斑秃的病因尚不完全清楚,越来越多证据表明,斑秃是一种T细胞介导的自身免疫疾病［1］。CD4+CD25+T细胞为具有独立功能的T细胞亚群,维持机体内环境的稳定、维持自身免疫耐受功能。其作用机制是通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制,如:分泌白介素(IL)10及转化生长因子(TGF)β发挥免疫抑制。TGF-β是一种重要的免疫调节因子, 目前发现 TGF-β 家族有 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,在免疫系统中,主要产生的是TGF-β1［2］。我们检测斑秃患者外周血CD4+CD25+T细胞培养上清液中IL-10及TGF-β1,探讨CD4+CD25+T细胞在斑秃发病机制中的作用。

一、对象与方法

1.一般资料:温州医科大学附属第二医院皮肤科门诊未经治疗的斑秃患者48例,均为斑片型,病期15 d至7年,其中活动期23例,表现为脱发斑不断扩大或有新的脱发斑出现,脱发斑边缘毛发牵拉试验阳性,男12例,女11例,年龄7～45岁,平均36.2岁。稳定期25例,表现为未见新脱发斑出现1个月以上,脱发斑边缘毛发牵拉试验阴性,可有少量细毛长出,男12例,女13例,年龄8～48岁,平均34.8岁。健康对照组为25例健康体检者,其中男13例,女12例,年龄8～50岁,平均38岁,均无毛发疾病、免疫性疾病及系统性疾病。以上3组具有可比性,在年龄及性别上差异无统计学意义。本研究经医学伦理委员会批准,研究对象均签署知情同意书。

2.实验试剂:人淋巴分离液、RPMI1640培养液购自美国Gibco公司,CD4+CD25+调节性T细胞磁珠分选试剂盒购自德国Miltenyi公司,鼠抗人CD3单克隆抗体、鼠抗人CD28单克隆抗体购自美国BD公司,IL-10、TGF-β1的ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

3.方法:CD4+CD25+T细胞的分离和培养:抽取研究对象肘静脉血20 ml,获取1×108个单一核细胞,加入人CD4+CD25+T细胞磁珠分选试剂盒中抗生物素Cocktail,孵育10 min,加入抗生物素微球,孵育15 min,200×g离心10 min。将LD柱子置于MidiMACS分选器中,收获细胞。加入抗CD4-F1TC标记的抗体,获取CD4+T细胞。重悬CD4+T细胞,每1×l07个细胞加入10 μl CD25微球,孵育15 min。将MS柱子置于MidiMACS分选器中,加入细胞悬液,收集CD4+CD25-T细胞。用含5%胎牛血清、HEPES和L-谷氨酰胺的RPMI1640培养液调整细胞浓度为2×104/ml,植入96孔细胞培养板中,每孔200 μl,实验组及对照组均加鼠抗人CD3单克隆抗体和鼠抗人CD28单克隆抗体,37℃5%CO2培养4 d,收集上清液。根据试剂盒说明书,ELISA方法检测细胞培养上清液的IL-10和TGF-β1水平。

3.统计学处理:实验结果用SPSS13.0统计软件作数据处理,3组样本的CD4+CD25+T细胞培养上清液的IL-10和TGF-β1数据采用±s表示,各组数据比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

进展期斑秃患者外周血CD4+CD25+T细胞分泌IL-10水平及TGF-β1低于健康对照组,稳定期斑秃患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞分泌IL-10水平及TGF-β1与健康对照组差异无统计学意义,进展期斑秃患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞分泌IL-10及TGF-β1水平低于稳定期斑秃患者。见表1。

三、讨论

初始CD4+T细胞在不同的条件下可分化成不同亚型的T淋巴细胞,包括有以CD4+CD25+为特征的调节性T细胞(Treg),根据其来源的不同可将分为天然型Treg和诱导型Treg,前者是以细胞直接接触的方式起作用,而后者是以细胞因子依赖的途径发挥作用［3］。Treg细胞能够控制免疫应答的强度,减轻对机体组织损伤,在很多自身免疫性疾病中被证实,包括有Ⅰ型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮［4-5］等。Treg的主要作用表现为免疫无能性和免疫抑制性,是外周免疫耐受形成机制的主要组成部分。其主要作用机制为分泌抑制性细胞因子(IL-10和TGF-β1)、表达细胞表面分子(CTLA-4、GITR 等)及 Foxp3 等［6］。IL-10 是一种重要的炎症抑制因子,通过抑制树突细胞和巨噬细胞产生炎性因子等机制来抑制Th1效应,也能通过抑制Th2细胞因子的产生。TGF-β能够抑制自身免疫反应,皮肤组织中低水平的TGF-β能降低局部皮肤免疫抑制功能,导致外周耐受被破坏［7］。斑秃的发病同毛囊的破坏有明显的关系,特别是进展期的斑秃,而斑秃患者外周血Treg功能及数量存在异常，这可能是斑秃患者外周血表现之一［8］。本研究通过斑秃患者外周血CD4+CD25+T细胞培养上清液IL-10和TGF-β1水平,结果显示在进展期斑秃患者中,水平明显低于稳定期和健康对照组,表明CD4+CD25+T细胞分泌抑制性细胞因子功能降低,和斑秃发病有一定关系。稳定斑秃患者CD4+CD25+T细胞培养上清液IL-10和TGF-β1未见明显降低,推测可能免疫抑制功能受损较轻。

表1 3组外周血CD4+CD25+T细胞培养上清液白介素10和转化生长因子β1(±s) pg/ml

表1 3组外周血CD4+CD25+T细胞培养上清液白介素10和转化生长因子β1(±s) pg/ml

注:a:与健康对照组比较(P＞0.05);b:与健康对照组比较(P＜0.05);c:与稳定期斑秃比较(P＜0.05)

组别 例数 白介素10 转化生长因子β1健康对照组 25 57.34±14.15 57.43±15.16稳定期斑秃 25 52.56±13.02a 61.75±14.10a进展期斑秃 23 31.68±6.78bc 32.29±6.80bc

［1］Cooper GS，Bynum ML，Somers EC.Recent insights in the epidemiology ofautoimmune diseases：improved prevalence estimates and understanding of clustering of diseases ［J］.J Autoimmun，2009，33(3-4)：197-207.

［2］Li MO，Flavell RA.TGF-beta：a master of all T cell trades［J］.Cell，2008，134(3)：392-404.

［3］Bluestone JA，Abbas AK.Natural versus adaptive regulatory T cells［J］.Nat Rev Immunol，2003，3(3)：253-257.

［4］Lawson JM，Tremble J，Dayan C，et al.Increased resistance to CD4+CD25hi regulatory T cell-mediated suppression in patients with type 1 diabetes［J］.Clin Exp Immunol，2008，154(3)：353-359.

［5］Valencia X，Yarboro C，Illei G，et al.Deficient CD4+CD25highT regulatory cell function in patients with active systemic lupus erythematosus［J］.J Immunol，2007，178(4)：2579-2588.

［6］Schubert LA，Jeffery E，Zhang Y，et al.Scurfin(FOXP3)acts as a repressor of transcription and regulates T cell activation ［J］.J Biol Chem，2001，276(40)：37672-37679.

［7］Li MO，Wan YY，Sanjabi S，et al.Transforming growth factor-β regulation of immune responses［J］.Annu Rev Immunol，2006，24：99-146.

［8］陈小敏，杨秀丽，史维平，等.斑秃患者外周血CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞及T淋巴细胞亚群的测定［J］.中华皮肤科杂志，2008，41(1)：29-31.

2013-07-08)

(本文编辑:吴晓初)

Detection of interleukin-10 and transforming growth factor-β1 in the culture supernatant of CD4+CD25+T cells from patients with alopecia areata

Ma Xinhua，Shao Wenjun，Jin Wanwan，Gao Yu.Department of Dermatology，Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325027，Zhejiang，China

ObjectiveTo evaluate the potential association of CD4+CD25+T cells with alopecia areata.MethodsTotally，this study enrolled 23 patients with progressive alopecia areata，25 patients with stable alopecia areata，and 25 healthy controls.Peripheral blood was isolated from these subjects followed by isolation of CD4+CD25+regulatory T cells，which were then cultured with the presence of anti-CD3 and-CD28 monoclonal antibodies for four days.Subsequently，enzyme-linked immunosorbent assay was performed to measure the levels of interleukin(IL)-10 and transforming growth factor(TGF)-β1 in the culture supernatant of these T cells.ResultsThe levels of IL-10 and TGF-β1 were(31.68± 6.78)pg/ml and(32.29 ± 6.8)pg/ml respectively in the culture supernatant of CD4+CD25+regulatory T cells from patients with progressive alopecia areata，significantly lower than those from the healthy controls((57.34±14.15)pg/ml and(57.43±15.16)pg/ml，bothP＜0.05)and patients with stable alopecia areata((52.56 ± 13.02)pg/ml and(61.75 ± 14.10)pg/ml，bothP ＜ 0.05).However，no significant difference was observed in the supernatant levels of IL-10 or TGF-β1 between the healthy controls and patients with stable alopecia areata.ConclusionsThe secretion of IL-10 and TGF-β1 by CD4+CD25+T cells is decreased in patients with progressive alopecia areata，which may contribute to the pathogenesis of alopecia areata.

Alopecia areata；Transforming growth factor beta1；Interleukin-10

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.017

浙江省温州市科技局对外合作课题(H20100016)

325027温州医科大学附属第二医院皮肤科

高宇,Email:gaoyu@medmail.com.cnCorresponding author：Gao Yu，Email：gaoyu@medmail.com.cn