胃癌组织中THBS2基因水平与MVD、MMP-2表达的相关性

聂 娜 吴小翎 宁 波 罗红春 刘 波 刘 倩

(重庆医科大学附属第一医院金山医院体检中心，重庆 401122)

胃癌的预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施有关〔1〕。但是，癌症的致病原因、发病机制都不是很明确，现在大量的学者都从基因水平研究胃癌细胞的生长、侵袭以及转移。血小板反应蛋白2(THBS2)基因是凝血酶敏感素家族成员之一〔2〕。本文通过检测胃癌组织以及正常胃黏膜组织THBS2基因水平，研究THBS2基因水平与微血管密度(MVD)、基质金属蛋白酶(MMP)-2表达的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院肿瘤科2012年6月至2014年2月的胃组织标本(石蜡包埋)110例，其中胃癌标准80例，正常胃旁黏膜组织30例。胃癌组织其中男51例，女27例，年龄35～75〔平均(55±11.797)〕岁，病理分型:早期胃癌 19 例，进展性胃癌有61例;组织分型乳头状腺癌18例、管状腺癌12例、低分化腺癌39例、黏液腺癌4例、印戒细胞癌7例;根据TNM分级标准:Ⅰ～Ⅱ15例，Ⅲ～Ⅳ65例;有淋巴转移68例，无淋巴转移12例。正常胃旁黏膜组织均取自胃癌组织半径5 cm范围外，男17例，女13例，年龄30～75岁〔平均(51±9.987)〕岁。

纳入标准:①可以收集到患者完整的检查和治疗资料。②未合并其他重要的合并症或者并发症，或者内分泌性疾病，未服用可能对研究指标有影响的药物。③患者在切除肿瘤前均未进行放、化疗，正常的胃黏膜组织无任何的癌细胞浸润。④符合伦理道德，家属或者患者签署知情同意书等。排除标准:①患有其他重要的器官衰竭性疾病，或者内分泌性疾病。②手术前服用可能影响研究效果和结局的药物。③在实验研究过程中，病人或者家属不依从、不配合、容易产生失访以及拒绝参加试验者。

1.2 实验试剂 细胞黏附分子CD34与MMP-2来自鼠抗人单克隆抗体，均购自上海宝曼生物科技有限公司。石蜡切片免疫组化采用EnVision二步法染色，上海芯超生物科技有限公司生产。Trizol总RNA抽取试剂盒，购自北京百泰克生物技术有限公司，逆转录试剂盒购自北京华大蛋白质研发中心有限公司，RT-PCR试剂盒、TaKaRa RNA kit购自大连宝生物公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取以及cDNA合成 RNA提取:50～100 mg组织中加入1 ml Trizol试剂;15℃ ～30℃静置5 min使核蛋白充分解离，加入0.2 ml(1 ml Trizol试剂)氯仿，充分剧烈振荡15 s，15℃ ～30℃ 静置 2 ～3 min，2℃ ～8℃ 12 000 r/min 离心15 min。加入0.5 ml异丙醇轻轻混匀，15℃ ～30℃静置10 min后，在管底出现胶状沉淀即为RNA，2℃ ～8℃ 12 000 r/min离心10 min后弃去上清，向沉淀中加入1 ml 75%乙醇，轻轻混匀，于2℃ ～8℃ 7 500 r/min离心5 min后弃上清，将RNA样品晾干(不要彻底干燥)，加入适量DEPC水溶解(可于55℃ ～60℃促溶10 min)，最后应用紫外分光光度仪分别测定A260和A280值以确定提取的RNA的纯度。置-80℃保存待用，所有的步骤都严格按照Trizol总RNA抽取试剂盒操作说明进行。严格按照逆转录试剂盒的操作要求将RNA逆转录为cDNA，20 μl反应体系中包括总 RNA 2 μg，5 ×Buffer 缓冲液 4 μl，25 nmol/LdNTPmix 1 μl，Oligo(dT)151 μl，RNA 酶抑制剂 1 μl，加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至20 μl。

1.3.2 PCR反应 应用primer-blast在线设计引物，正义链(5＇→ 3 ＇)GACGGCATCCAGTACAGAGG;反 义 链 (5 ＇→ 3 ＇)TTTCAGTGTTCCGGACCGAG，片段长度186 bp，应用RT-PCR试剂盒进行多份PCR反应，严格按照试剂盒的操作进行。

1.3.3 CD34与MMP-2免疫组化染色 利用采用EnVision二步法，分别检测胃癌组织和正常胃黏膜组织中CD34与MMP-2的表达水平，严格按照操作说明书进行检测和染色。MMP-2蛋白水平的判断方法:均定位于胃癌细胞质或者胞膜，阳性表达为黄色颗粒或者棕黄色颗粒。在光镜下选择具有代表性的区域计算阳性细胞数并且积分，MVD的判断方法:采用最高血管密度计数法，一般CD34阳性染色定位在血管内皮细胞膜或胞质，呈棕黄色。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件行t及χ2检验。

2 结果

2.1 胃癌组织和胃正常黏膜组织中THBS2基因的表达 胃癌组织中THBS2基因水平为-1.2±0.05，而正常的胃黏膜组中为-1.82±0.12，两组之间的差异显著(P＜0.05)。

2.2 THBS2基因表达与MMP-2蛋白水平的相关性 THBS2基因高表达51例，低表达29例，在THBS2基因高表达的区域中MMP-2蛋白表达阴性6例，弱阳性15例，阳性30例;THBS2基因低表达的区域中MMP-2蛋白表达阴性5例，弱阳性10例，阳性有14例。THBS2基因高表达与低表达与MMP-2蛋白表达具有密切的关系(P＜0.05)。见表1。

表1 THBS2基因表达与MMP-2蛋白水平相关性(s)

表1 THBS2基因表达与MMP-2蛋白水平相关性(s)

组别 n THBS2基因 阴性 弱阳性 阳性 r值 P值MMP-2蛋白表达高表达 51 -1.12±0.021.20±0.11 2.89±1.25 4.35±1.370.673 0.000低表达 29 -1.53±0.040.67±0.09 2.12±1.50 3.34±1.25 0.485 0.000 t值 4.373 2.899 3.23 2.39 P值0.011 0.032 0.021 0.045

2.3 THBS2基因表达与MVD的相关性 胃癌组织中MVD为45.34±12.35，与 THBS2 基因表达水平呈正相关(r=0.432，P=0.001)。

3 讨论

THBS2基因是凝血酶敏感素家族成员之一，属于多功能细胞间糖蛋白，含有多种结合位点，主要有凝血酶、纤维蛋白原以及肝素等。大量的文献资料表明THBS2基因在大多数肿瘤的发生发展中起着重要的作用，尤其是在胃癌组织中异常表达〔2〕。THBS2基因主要在肿瘤组织中微血管的产生中起调节作用，是必不可少的因素〔3，4〕。

本文结果显示，THBS2基因在胃癌组织中微血管的形成中发挥重要的作用，THBS2基因与MVD与MMP-2表达呈现正相关关系，说明MVD与MMP-2表达水平随着THBS2基因的表达水平升高而升高，THBS2基因变化可能是通过促进 MVD、MMP-2表达实现的〔5，6〕，但是这种作用还要进一步研究。

1 熊元刚，刘金彦.36例青年人胃癌治疗体会〔J〕.辽宁医学院学报，2013;34(1):70-1.

2 力 超，林贤东，蔡晓雯，等.凝血酶敏感素-2在胃癌中的表达及其临床意义〔J〕.中国肿瘤临床，2013;40(20):1227-31.

3 席 妍，王彦荣，冯立艳，等.非小细胞肺癌组织MMP-2表达及MVD 的研究〔J〕.中国实验诊断学，2010;14(12):1960-2.

4 李平栋，于振坤，黄志刚，等.喉癌MMP-2和TIMP-2表达与瘤内微血管密度的相关性〔J〕.中国耳鼻咽喉头颈外科，2007;14(9):514-8.

5 王 军，罗 兵.基质金属蛋白酶及其抑制物与肿瘤相关性研究进展〔J〕.实用医药杂志，2006;23(2):218-21.

6 Reis PP，Waldron L，Perez-Ordonez B，et al.A gene signature in histologically normal surgical margins is predictive of oral carcinoma recurrence〔J〕.BMC Cancer，2011;11:437.