胎鼠间充质干细胞对老年小鼠肺功能的影响

朱锦灿 陈小宇 祝爱珍 刘成成 李 军 刘革修 (暨南大学血液病研究所，广东 广州 510632)

间充质干细胞(MSCs)在体内的主要作用是通过形成新的组织间质结构，替代老化的间质结构，并能分化成多种新的组织细胞〔1〕。有研究报导小鼠MSCs能在小鼠体内分化成肺上皮细胞〔2〕。这提示补充生长状态良好的MSCs有利于其发挥修复损伤作用，通过输注MSCs可能起到延缓老年人肺的肺脏退行性变的作用。本研究对老年小鼠输注外源性MSCs，观察其对老年小鼠肺功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 孕13.5 d BALB/c小鼠4只，12月龄SPF级雌性BALB/c小鼠48只，体重(28±2)g，购于四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所，动物合格证号:SCXK(川)2004-15。将小鼠随机分成移植组和对照组，每组24只。整个动物实验均遵守中国科学技术委员会颁发的实验动物管理条例。

1.2 材料 DMEM-F12液体培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，Vevo770Ⓡ高分辨率小动物超声系统(Visual Sonics公司)，血乳酸(BLA)(南京建成生物工程研究所)，地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、异丁基甲基黄嘌呤、抗坏血酸、β-磷酸甘油、茜素红(Sigma公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 胎鼠MSCs的复苏与培养 胎鼠MSCs的提取、培养与鉴定见文献〔3〕，保存于本实验室液氮中。使用时从液氮中取出冻存管，于37℃水浴中不断搅动，使之迅速融化，吸出溶有细胞的冻存液加入事先准备好的液体培养基中(37℃预热，10倍体积)的离心管中，吹打，低速室温离心(1 000 r/min，5 min)，上清液后重新制备细胞悬液，接种于含10%胎牛血清的DMEMF12完全培养基(含青、链霉素各100 U/ml)中，于37℃ 5%CO2饱和湿度培养箱中培养，24 h后全量换液，每3天换液1次。

1.3.2 移植胎鼠MSCs 取第3代胎鼠MSCs(约107个细胞)以尾静脉注射的方式，对移植组每只小鼠进行1次/月，连续注射3次胎鼠MSCs移植;同时在相同的条件下给予对照组小鼠注射等体积生理盐水。

1.3.3 小鼠一般情况 对移植前后两组小鼠进行形态改变、精神状况以及活动度的观察比较。

1.3.4 负重游泳试验 随机选取两组小鼠各8只，于移植胎鼠MSCs 3个月后进行负重游泳实验，其中游泳箱水深40 cm，水温(25±0.5)℃，水流速度8 L/min，小鼠尾根部捆绑铅皮(质量约为体重的5%)，记录每只小鼠从放入水中至小鼠失去协调运动，10 s内未能浮出水面的时间，并取出小鼠，毛巾拭干。

1.3.5 血清乳酸含量测定 随机选择对照组和移植组小鼠各8只，分别在上述游泳箱里游泳5min，分别于游泳前、游泳结束0、5 min 3个时间点尾静脉各取血20 μl，系统稀释液稀释后，血乳酸分析仪检测各组小鼠血清中血乳酸的含量〔3〕。

1.3.6 超声心动图情况 于胎鼠MSCs移植前以及移植3个月后，分别从对照组和移植组中随机各选取8只小鼠，用Vevo770Ⓡ高分辨率小动物超声系统测量各组小鼠肺动脉流速、心输出量、左心室舒张末容积、每搏量。

1.3.7 组织学检查结果 颈椎脱臼法处死全部小鼠，在肺相同部位取材，制作成石蜡切片后做肺组织学检查，通过0～4分法双盲打分法对小鼠肺脏组织衰老程度进行评价〔4〕。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件分析，计量资料采用s表示，行两独立样本t检验。

2 结果

2.1 移植后小鼠一般情况观察 小鼠经3次胎鼠MSCs输注后未见输注对其造成不良影响。与对照组相比，移植组小鼠的活动量、精神状态、毛发光泽度，食欲均有所改善。移植前以及移植3个月后两组小鼠体重无显著性差异。

2.2 MSCs对小鼠负重游泳时间的影响 移植MSCs 3个月后，与对照组小鼠负重游泳时间(982±65)s相比，移植组小鼠负重游泳时间(1 511±72)s有所增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 MSCs对小鼠运动前后血清乳酸的影响 经5 min游泳试验后，对照组小鼠血清乳酸含量较运动前明显增加，休息10 min后血乳酸水平有所下降，但仍高于运动前;移植组小鼠运动后血乳酸含量也有升高，但较对照组低，差异有统计学意义(P＜0.05)，休息10 min后移植组小鼠血乳酸值下降明显，接近运动前的数值。见表1。

表1 移植MSCs对游泳实验前后各组小鼠血清乳酸含量的影响(s，n=8，mmol/L)

表1 移植MSCs对游泳实验前后各组小鼠血清乳酸含量的影响(s，n=8，mmol/L)

与对照组比较:1)P＜0.05

10 min对照组组别 游泳前 游泳结束0 min 游泳结束3.98 ±0.26 8.02 ±0.58 7.11 ±0.48移植组 3.75 ±0.31 7.23 ±0.391) 5.43 ±0.431)

2.4 超声心动图情况 移植MSCs 3个月后，经心脏超声测量结果发现;移植组肺动脉平均血流速度较对照组(P＜0.05)。移植组中心脏输出量、每搏输出量、左室舒张期容积均较对照组小鼠高。见图1。

2.5 组织学检查结果 胎鼠MSCs移植3个月后，肺组织学检查显示，对照组肺脏的正常肺泡结构破坏，气腔扩大，呈肺气肿改变等肺退行性变化征象。而移植组肺退行性变化征象明显减轻。通过评价组织衰老程度的0～4分法双盲打分显示对照组衰老程度〔(1.35 ±1.16)〕较移植组〔(2.5 士1.15)〕轻(P ＜0.05)。见图 2。

图1 超声心动图显示两组肺动脉流速对比

图2 两组肺组织学对比(×100)

3 讨论

12月龄BALB/c雌性小鼠(平均寿命多报道为561 d)肺脏会出现老年小鼠肺衰老的组织病理学变化:肺泡间隔明显增宽，局部肺泡腔消失，实性变，肺间质纤维结缔组织增生，肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞增生，呈老年性肺气肿征象。因此我们在选取12月龄BALB/c雌性小鼠作为老年老鼠模型的基础上，研究胎鼠MSCs能否改善老年小鼠的肺组织病理学及功能的退行性变化。首先我们成功提取胎鼠MSCs并通过流式细胞术、成脂油红O染色及成骨茜素红染色实验鉴定了我们的实验细胞为MSCs。接着对移植组小鼠输注胎鼠MSCs 3个月后，通过与对照组做对比，发现小鼠做负重游泳试验及限时游泳后检测血清乳酸含量发现移植胎鼠MSCs能有效提高运动耐力，从侧面反映了移植胎鼠MSCs后，其心肺功能较对照组有所改善。超声心动图检查后发现移植MSCs后的小鼠左心功能各指标(心输出量、左心室舒张末容积、每搏量)均有明显的改善，与已有研究报道一致〔5〕，肺动脉流速也明显下降。说明移植胎鼠MSCs后，小鼠的肺循环有明显改善。同时组织切片显示小鼠肺脏组织学衰退减轻。

以往研究发现，当将老年动物的细胞置于年轻动物的血液中，能起到使衰老的细胞变得年轻的作用〔6〕。在本实验中我们通过小鼠负重游泳及限时游泳后检测血清乳酸含量游泳前后的变化间接说明移植MSCs后小鼠的心肺功能有所改善，运动耐力有所提高。因为心肺功能的增强能为其运动时提供足够的氧及能量，从而增加了有氧代谢，减少无氧酵解，达到减少了乳酸生成的作用。同时增强肝脏对乳酸的分解，提高机体耐力。同时，小鼠超声心动图检查直接证明小鼠的左心功能有所改善，与此同时，肺动脉血流速度的减慢，说明了肺动脉压的下降，老年小鼠常见的老年性肺气肿有所改善。联合左心功能的改善及肺循环的改善，共同证明这胎鼠MSCs能改善老年心肺功能。对于胎鼠MSCs之所以能延缓老年小鼠肺的组织学衰老及改善肺功能衰退，可能通过以下机制:MSCs在肺内的植入后通过分化为肺泡上皮细胞〔7～9〕(Ⅰ型肺泡上皮细胞〔7〕或Ⅱ型肺泡上皮细胞〔8〕)或分化为血管内皮细胞〔10〕，改善肺毛细血管网，从而改善肺组织的供血供氧和肺换气功能。或者随着MSCs在肺内的植入，分泌相关的多种细胞因子，最后达到修复肺组织的老化损伤，逆转肺气肿征象的作用。与此同时，向全身各组织器官输送氧量增加，肺循环的改善对左心功能的改善起到积极作用。

1 François S，Bensidhoum M，Mouiseddine M，et al.Local irradiation not only induces homing of human mesenchymal stem cells at exposed sites but promotes their widespread engraftment to multiple organs:a study of their quantitative distribution after irradiation damage〔J〕.Stem Cells，2006;24(4):1020-9.

2 Anjos-Afonso F，Siapati EK，Bonnet D.In vivo contribution of murine mesenchymal stem cells into multiple cell-types under minimal damage conditions〔J〕.J Cell Sci，2004;117(Pt 23):5655-64.

3 Tan W，Yu KQ，Liu YY，et al.Anti-fatigue activity of polysaccharides ex tract from Radix Rehmanniae Preparata〔J〕.Int J Biol Macromol，2012;50(1):59-62.

4 Schriner SE，Linford NJ，Martin GM，et al.Extension of murine lifespan by over expression of catalase targeted to mitochondria〔J〕.Science，2005;308(5730):1909-11.

5 祝爱珍，刘成成，陈小宇，等.胎鼠间质干细胞对老年小鼠心血管系统衰老的影响〔J〕.中国老年学杂志，2012;32(23):5193-5.

6 Conboy IM，Conboy MJ，Wagers AJ，et al.Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment〔J〕.Nature，2005;433(7027):760-4.

7 Kotton DN，Ma BY，Cardoso WV，et al.Bone marrow-derived cells as progenitors of lung alveolar epithelium〔J〕.Development，2001;128(24):5181-8.

8 Nan Ma，Hui Gai，Ju Mei，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into type II alveolar epithelial cells in vitro〔J〕.Cell Biol Int，2011;35(12):1261-6.

9 Ortiz LA，Gambelli F，McBride C，et al.Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2003;100(14):8407-11.

10 Portalska KJ，Leferink A，Groen N，et al.Endothelial differentiation of mesenchymal stromal cells〔J〕.PLoS One，2012;7(10):e46842.