HPLC法研究唑尼沙胺分散片在中国健康志愿者的药动学

戴 青，陈勇川，邱学文，向荣凤，熊丽蓉（第三军医大学西南医院药剂科，国家药品临床研究基地，重庆 400038）

唑尼沙胺（zonisamide，ZNS），化学名为1，2-苯并异 唑-3-甲磺酰胺[1-2]，是新型广谱抗癫痫药物，1989年在日本首次获准上市。临床上常用于癫痫大发作、小发作、局限性发作、癫痫持续状态及精神运动性发作等治疗[3]。

国内曾有HPLC法[4-6]检测唑尼沙胺血药浓度的报道，其分析过程复杂，以磷酸盐缓冲液[4，6]作为流动相，由于磷酸盐不易清洗，对色谱柱及液相色谱系统均易造成损害。本实验改用乙腈-0.1%三氟乙酸作为流动相，其配制过程简单且易冲洗。在血样的处理上，文献[6]采用液液萃取的方法，实际操作繁琐且耗时，本文选用6%高氯酸沉淀蛋白，所需体积少（只需与血样等体积即可），沉淀蛋白效果明显，无干扰，分析时间短。本实验快捷、简便、灵敏度高，通过对唑尼沙胺药动学的研究，以期为临床用药提供参考。

1 仪器与试药

Waters 2690 Alliance液相色谱仪（含Waters 2487紫外检测器，Millennium32数据采集处理软件，美国Waters公司）；高速离心机（美国Abbott公司）；Milli-Q plus超纯水器（美国Millipore公司）；KQ-400KDE型高功率数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Vortex Genius 3圆周振荡器（德国IKA公司）。

唑尼沙胺分散片（苏州工业园区天龙制药有限公司，规格：100 mg，批号081125）；唑尼沙胺标准品（苏州工业园区天龙制药有限公司，含量：99.8%，批号080601）；羟苯甲酯标准品（苏州工业园区天龙制药有限公司，批号090915）；乙腈为色谱纯（美国迪马公司）；高氯酸为分析纯（成都天华科技股份有限公司）；三氟乙酸为分析纯（天津市光复精细化工研究所）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸（33∶67）；流速：1.6 mL·min-1；检测波长：284 nm；进样量：20 μL。

2.2 受试者选择

共入选30名健康志愿者，经常规体检、心电图及生化检验结果均正常，精神状态良好。受试前2周及实验期间未服用其他药物，实验期间忌烟、酒和油腻食物，统一饮食，受试者对实验目的和要求完全知情，实验前志愿签署知情同意书，并经本院伦理委员会的批准。单次给药女性受试者15例，年龄（26.47 ± 6.47）岁，身高（156.87 ± 4.29） cm，体质量（52.47 ± 5.29） kg；单次给药男性受试者15例，年龄（21.60 ± 0.91）岁，身高（171.67 ± 5.81） cm，体质量（61.87 ± 5.52） kg。多次给药女性受试者5例，年龄（22.40 ± 0.55）岁，身高（159.20 ± 3.70） cm，体质量（52.10 ± 2.25） kg；多次给药男性受试者5例，年龄（23.00 ± 1.00）岁，身高（173.20 ± 5.45） cm，体质量（68.00 ± 4.36） kg。其中，多次给药组一名受试者在实验服药阶段自动退出，多次给药组实际完成9例。

2.3 实验方案

单次给药：30名受试者（15名男性，15名女性）随机分配至3个剂量组（200、300、400 mg），每组10人。每位受试者早晨空腹用200 mL温水口服设定剂量的唑尼沙胺分散片，给药后2 h方可饮水，4 h后进统一标准餐。分别于给药前和开始给药后1、2、3、4、5、6、8、12、24、48、72、120、180、240和300 h取静脉血4.0 mL，肝素抗凝，离心5 min（4000 r·min-1），分离血浆，– 65 ℃冷冻保存至测定。

多次给药：文献[7]报道唑尼沙胺达到稳态需要13～ 14 d，10名参加300 mg单次剂量组的受试者于单剂量实验结束后第3天进入多剂量研究，每天一次服用唑尼沙胺分散片300 mg，连续服用14 d。在第12、13、14次给药前和第14次给药后1、2、3、4、5、6、8、12、24、48、72、120、180、240和300 h取静脉血4.0 mL，肝素抗凝，离心5 min（4000 r·min-1），分离血浆，– 65 ℃冷冻保存至测定。

2.4 标准溶液的制备

精密称取唑尼沙胺标准品10.02 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混匀，备用。

精密称取羟苯甲酯（内标）标准品10.00 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混匀；再从中取2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，混匀，备用。

2.5 血浆样品处理

取待测血浆0.25 mL，加入10 μL内标乙腈液（0.2 mg·mL-1），混匀30 s，再加入6%高氯酸0.25 mL，振荡混匀2 min，离心5 min（13 000 r·min-1），取上清液20 μL进样。

2.6 专属性考察

由图1可见，在本实验条件下，唑尼沙胺与羟苯甲酯（内标）互不干扰且与血浆中内源性杂质分离良好，唑尼沙胺的保留时间约为4.551 min，羟苯甲酯的保留时间约为6.036 min。

2.7 标准曲线的绘制

空白血浆中加入唑尼沙胺标准溶液适量，再依次用空白血浆稀释成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL-1系列的浓度，按“2.5”项下方法处理后进行高效液相测定，记录色谱图，将唑尼沙胺与内标的峰面积比值（R）对浓度（C）进行线性回归，得回归方程：R = 1.45C – 6.09 × 103（r = 0.999 5，n = 9），线性范围：0.1 ～ 40.0 μg·mL-1，最低定量限为0.1 μg·mL-1。

2.8 精密度和回收率实验

空白血浆中加入唑尼沙胺标准溶液适量，配制成低、中、高三种不同浓度（0.2、2.0、20.0 μg·mL-1），按“2.5”项下方法处理后进样，各浓度日内重复测定5次，并连续测定5 d，计算日内、日间的精密度和方法回收率，结果见表1。

2.9 稳定性考察

图1 唑尼沙胺HPLC色谱图A – 空白血浆，B – 标准血样（含10 μg·mL-1的唑尼沙胺和8 μg·mL-1的羟苯甲酯)，C – 受试者服药后6 h血浆样品；1 – 唑尼沙胺，2 – 羟苯甲酯Fig 1 HPLC chromatograms of zonisamideA – blank plasma, B – standard plasma with zonisamide 10 μg·mL-1 and methylparaben 8 μg·mL-1, C – human plasma samples of the volunteer after oral administration with drugs for 6 h; 1 – zonisamide,2 – methylparaben

表1 精密度和回收率实验测定结果. n = 5Tab 1 Test results of precision and recovery. n = 5

将加入唑尼沙胺的血浆样品分别在– 65 ℃低温冰箱冻存52 d、室温放置3 h、血浆样品反复冻融3次、血浆样品经处理后在10 ℃放置28 h，其含量没有明显变化，详见表2。

表2 稳定性实验测定结果. μg·mL-1，x ± s，n = 9Tab 2 Test results of stability. μg·mL-1, x ± s, n = 9

2.1 0 数据处理

Cmax和tmax均以实测值表示；AUC0-t以梯形法计算，AUC0-∞按公式计算：AUC0-∞= AUC0-t+ Ct/λz（t为最后一次可实测血药浓度的采样时间；Ct为末次可测样本血药浓度；λz为对数药-时曲线末端直线部分求得的末端消除速率常数）；t1/2= 0.693/λz。药动学基本参数的计算与统计学检验分析借助DAS 2.1.1软件完成。

2.1 1 药-时曲线

30名受试者单次口服（低剂量200 mg，中剂量300 mg，高剂量400 mg）唑尼沙胺分散片的血药浓度均值-时间曲线见图2，9名受试者多剂量口服唑尼沙胺（300 mg）后的平均血药浓度-时间曲线见图3。

图2 单次口服唑尼沙胺200、300、400 mg后的平均药-时曲线. n = 10Fig 2 Concentration-time curves after single oral administration of zonisamide with the dose of 200, 300, 400 mg. n = 10

图3 多次口服唑尼沙胺300 mg后的平均药-时曲线. n = 9Fig 3 Concentration-time curve after multiple dose administration of zonisamide 300 mg. n = 9

2.1 2 药动学参数

30名健康受试者单剂量口服200、300、400 mg唑尼沙胺后测得血浆中的主要药动学参数和9名健康受试者多剂量口服300 mg唑尼沙胺后测得血浆中的主要药动学参数见表3。

表3 单剂量及多剂量口服唑尼沙胺后血浆主要药动学参数测定结果. x± sTab 3 Determination results of main pharmacokinetic parameters of zonisamide in plasma after single or multiple oral administration. ±s

表3 单剂量及多剂量口服唑尼沙胺后血浆主要药动学参数测定结果. x± sTab 3 Determination results of main pharmacokinetic parameters of zonisamide in plasma after single or multiple oral administration. ±s

参数单次给药（n = 10） 300 mg多次给药（n = 9 ）200 mg 300 mg 400 mg t1/2/h 78.276 ± 16.074 66.316 ± 11.585 66.971 ± 12.821 59.286 ± 8.882 tmax/h 3.300 ± 1.567 4.400 ± 2.875 5.200 ± 2.530 2.556 ± 0.726 C/μg·mL-1 2.699 ± 0.806 4.372 ± 0.899 6.668 ± 1.692 27.305 ± 5.201 max AUC/μg·h·mL-1 222.122 ± 47.188 386.182 ± 69.693 550.010 ± 181.734 2 522.230 ± 720.554 0-∞AUC/μg·h·mL-1 205.858 ± 45.684 368.021 ± 62.976 521.375 ± 165.537 2 435.713 ± 668.845 0-t C/μg·mL-1– – – 21.939 ± 4.440 min C/μg·mL-1– – – 24.197 ± 4.716 av AUC/μg·h·mL-1 – – – 580.722 ± 113.189 ss

2.1 3 药品不良反应评价

实验过程中共23例受试者出现药品不良反应，具体表现为心慌、心跳加速、气促、头昏、嗜睡、乏力、运动失调、反应迟缓、注意力下降，未给予其他治疗随后自行缓解，属轻度不良反应。

3 讨论

3.1 方法与分析

紫外光谱显示，唑尼沙胺吸收波长约为240 nm及284 nm，240 nm的吸收强度最大，为避免血浆内源性杂质的干扰，本文选择284 nm作为测定波长。实验中曾将甲硝唑、替硝唑、奥硝唑、羟苯乙酯、羟苯甲酯作为内标，因羟苯甲酯在流动相及血样处理所具有的酸性条件下性质稳定，并具有合适的保留时间，与唑尼沙胺及血浆内源性杂质分离良好，无干扰，且价廉易得，故将其作为内标。有文献[6]报道，唑尼沙胺在人体单剂量及多剂量实验中因浓度范围相差较大，采用不同浓度范围的定量标准曲线，考虑到其操作繁复，本实验只需做同一标准曲线即能覆盖绝大多数样本，线性范围为0.1 ～ 40.0 μg·mL-1（r = 0.999 5，n = 9）。方法学研究结果表明，该方法具有良好的精密度、准确度和灵敏度，实验稳定性好，操作快捷、简便，能够满足唑尼沙胺人体药动学研究的需要。

3.2 药动学分析

本实验所得药动学参数与文献[6，8-9]报道类似，受试者服药后2 ～ 6 h达到峰浓度。在200 ～ 400 mg剂量范围内，唑尼沙胺的AUC0-t、AUC0-∞、Cmax均与剂量呈线性关系。单次给药数据显示，3组剂量中男性Cmax均较女性明显偏低，而男性t1/2明显较女性延长。唑尼沙胺属于磺胺衍生物，对红细胞有较高的亲和力，因男性血液中红细胞含量较女性多，推测男性服药后药物与红细胞结合较多，随后药物逐渐释放消除，这可能是男性表现为峰浓度较低、消除较慢的原因。由于药物与红细胞的结合具有饱和性，当多次给药后结合达到饱和状态，性别间红细胞含量的绝对差异被饱和效应所稀释，使得唑尼沙胺300 mg每日1次，连续14 d给药后的Cmax和t1/2性别间差异较单次给药减小。多次给药后平均积蓄因子R为（10.117 ± 1.927），提示该用药方案给药后唑尼沙胺在人体内有明显的蓄积。单次给药和多次给药后Cmax、AUC0-t、AUC0-∞存在显著性差异，唑尼沙胺在连续给药14 d后，可达稳态血药浓度。

整个实验过程由经《药物临床试验管理规范》（GCP）培训的临床医师和护士进行观察，除轻度不良反应外，无严重不良事件发生，表明实验药物在实验剂量下具有较好的安全性[10]。