rhCNTF对Aβ损伤海马神经元的作用机制研究

张 琴，刘泽源，曲恒燕（军事医学科学院附属医院临床药理学研究室，北京 100071）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种进行性中枢神经系统退行性疾病。目前，治疗药物仅能改善AD患者的部分症状，而不能减轻神经细胞的退化和AD疾病的发展进程，故需寻求能够营养或修复神经元、改善AD病理进展的药物。AD主要的病理特征为β淀粉样肽（β-amyloid fragment，Aβ）沉积所形成的老年斑和tau蛋白过度异常磷酸化导致的神经纤维缠结[1]。Aβ的沉积和聚集是导致AD发生的重要因素[2-3]，而聚集态的 Aβ25-35是β淀粉样肽对神经元的直接毒性片段[4]。重组人睫状神经营养因子（recombinant human ciliary neurotrophic factor，rhCNTF）能够维持多种神经细胞的存活，阻止体内神经元的退行性丧失[5-6]。本实验采用聚集态Aβ25-35损伤体外培养的海马神经元以模拟体内神经元受损状态，考察rhCNTF对损伤细胞的作用及相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

新生24 h的Wistar乳鼠，SPF级，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-（军）2012-0004。

1.2 药物与试剂

rhCNTF（美国Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；马血清（Gibco公司）；DMEM培养基（HyClone公司）；N-2（Gibco公司）；B-27（Gibco公司）；阿糖胞苷（美国Sigma公司）；Aβ25-35（美国Sigma公司）；多聚赖氨酸（美国Sigma公司）；NSE免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；CCK-8溶液（日本株式会社同仁化学研究所）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.3 仪器

倒置荧光显微镜IX-51（Olympus公司）；全自动酶标仪-128C（CliniBio公司）；流式细胞仪（Becton Dickinson公司）。

1.4 海马神经元的分离与培养

取新生24 h的Wistar乳鼠，酒精消毒断头后，分离海马组织，将其放入盛有预先冰冷的解剖液的平皿中，用0.25%胰蛋白酶于37 ℃消化20 min，800 r·min-1离心5 min后用种植液重悬、过滤，制成细胞悬液，活细胞以106个· mL-1的密度接种在涂有多聚赖氨酸的6孔板中，置37 ℃、5% CO2孵育箱培养。24 h后镜下可见细胞贴壁生长，进行全量换成含N-2和B-27的饲养液，以后隔天半量换液。培养72 h后加阿糖胞苷以抑制非神经元细胞生长。

1.5 海马神经元的鉴定

将培养至第7天的海马神经元进行SABC法免疫组化鉴定，实验操作按照武汉博士德生物工程有限公司NSE免疫组化试剂盒的说明进行。

1.6 CCK-8法检测海马神经元的活动度

1.6.1 Aβ25-35损伤后再给予rhCNTF 将Aβ25-35于37 ℃温育72 h，使其成为有直接毒性的凝聚态，并使Aβ25-35的终浓度为10 μmol·L-1；使rhCNTF溶液的终浓度为100 ng·mL-1。培养至第7天的海马神经元以5×105个·mL-1的密度种植到96孔板用于实验。实验分组为：空白组；对照组（DMEM培养基）；Aβ25-35组（10 μmol·L-1）；rhCNTF组（100 ng·mL-1）；Aβ25-35+ rhCNTF组（10 μmol·L-1的Aβ25-35+ 100 ng·mL-1的rhCNTF）。待细胞贴壁后，加入Aβ25-35溶液孵育24 h，加入rhCNTF溶液孵育24 h。加入CCK-8溶液孵育2 h，于450 nm波长处用全自动酶标仪测定吸光度值（A450）。计算细胞活动度，细胞活动度=A450（试验组-空白组）/A450（对照组-空白组）×100%。

1.6.2 rhCNTF预防后再给予Aβ25-35实验分组为：空白组；对照组（DMEM培养基）；Aβ25-35组（10 μmol·L-1）；rhCNTF 组（100 ng·mL-1）；rhCNTF + Aβ25-35组（100 ng·mL-1的rhCNTF + 10 μmol·L-1的Aβ25-35）。待细胞贴壁后，加入rhCNTF孵育24 h，加入Aβ25-35溶液孵育24 h。加入CCK-8溶液孵育2 h，用全自动酶标仪测定吸光度值（A450），计算细胞活动度。

1.7 海马神经元早期凋亡的测定

采用Annexin V-FITC/PI法凯基生物试剂盒进行流式细胞术检测细胞凋亡。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 海马神经元的鉴定

培养7 d的海马神经元经NSE免疫组化鉴定，阳性细胞的胞浆被染成棕黄色。图1为成熟生长的海马神经元，突起生长繁多，神经细胞交错成网格。

图1 海马神经元的鉴定（× 200）Fig 1 Identification of hippocampal neurons (× 200)

2.2 rhCNTF促进海马神经元生长

rhCNTF作用的海马神经元的细胞活动度与rhCNTF的浓度呈指数相关。详见图2。

图2 rhCNTF对海马神经元的促生长作用. x ± s, n = 3Fig 2 The growth-promoting effect of rhCNTF on hippocampal neurons.x ± s, n = 3

2.3 rhCNTF对Aβ25-35损伤的海马神经元有改善作用

Aβ25-35组可见淀粉样沉淀且细胞活动度降低，而rhCNTF可改善Aβ25-35的损伤作用，不仅使神经元形态正常而且使细胞活动度明显增加（P ＜ 0.01）。详见图3、图4。

图3 海马神经元的形态观察（×100）A – 对照组，B – Aβ25-35（10 μmol·L-1）组，C – Aβ25-35（10 μmol·L-1）+rhCNTF（100 ng·mL-1）组，D – rhCNTF （100 ng·mL-1）组Fig 3 Microscopic observation of morphology of hippocampal neurons (×100)A – control group, B – Aβ25-35 (10 μmol·L-1) group, C – Aβ25-35 (10 μmol· L-1)+ rhCNTF (100 ng·mL-1) group, D – rhCNTF (100 ng·mL-1) group

图4 海马神经元细胞活动度的变化. n = 6A – 对照组，B – Aβ25-35（10 μmol·L-1）组，C – Aβ25-35 (10 μmol·L-1) +rhCNTF (100 ng·mL-1)组，D – rhCNTF (100 ng·mL-1)组注：与A组比较，*P = 0.000 4；与B组比较，#P = 0.002 2Fig 4 Variation of cell viability of hippocampal neurons. n = 6 A – control group, B – Aβ25-35 (10 μmol·L-1) group, C – Aβ25-35 (10 μmol·L-1) + rhCNTF (100 ng·mL-1) group, D – rhCNTF (100 ng·mL-1) groupNote: compared with group A, *P = 0.000 4; compared with group B,#P = 0.002 2

2.4 rhCNTF预防海马神经元免受损伤

rhCNTF预处理海马神经元后，Aβ25-35对细胞的生长密度和树突结构无明显影响；rhCNTF + Aβ25-35组的细胞活动度较Aβ25-35组显著增加（P ＜ 0.000 1）。见图5、6。

图5 经 rhCNTF预防下的海马神经元的形态（×40）A – 对照组，B – rhCNTF（100 ng·mL-1） + Aβ25-35（10 μmol·L-1）组，C –rhCNTF （100 ng·mL-1）组Fig 5 Morphology of hippocampal neurons treated with rhCNTF prevention (×40)A – control group, B – rhCNTF (100 ng·mL-1) + Aβ25-35 (10 μmol·L-1)group, C – rhCNTF (100 ng·mL-1) group

图6 rhCNTF预防下的海马神经元的细胞活动度. n = 3A – 对照组，B – Aβ25-35（10 μmol·L-1）组，C – rhCNTF (100 ng·mL-1) +Aβ25-35 (10 μmol·L-1)组，D – rhCNTF (100 ng·mL-1)组注：与A组比较，*P = 0.046 4；与B组比较，#P ＜ 0.000 1Fig 6 Cell viability of hippocampal neurons treated with rhCNTF prior to Aβ25-35 by CCK-8. n = 3A – control group, B – Aβ25-35 (10 μmol·L-1) group, C – rhCNTF (100 ng·mL-1) + Aβ25-35 (10 μmol·L-1) group, D – rhCNTF (100 ng·mL-1) groupNote: compared with group A, *P = 0.046 4; compared with group B,#P ＜ 0.000 1

2.5 rhCNTF降低海马神经元的早期凋亡

Q1象限表示为坏死细胞，Q2象限为晚期凋亡细胞和机械损伤细胞，Q3象限为早期凋亡细胞，Q4象限为正常活细胞。相对于对照组的细胞凋亡率（3.77%），Aβ25-35组的细胞凋亡率（7.33%）较高，而Aβ25-35+ rhCNTF组的细胞凋亡率（6.75%）有所降低。详见图7。

3 讨论

海马神经元是哺乳动物学习记忆和认知功能的重要神经细胞。海马神经元的萎缩或损伤会导致学习记忆、认知功能以及生活能力的减退，也是导致AD的关键神经元[7]。本实验体外培养乳鼠海马神经元，并采用免疫细胞化学方法对NSE染色，成功鉴定海马神经元，模拟体内海马神经元的生存状况以及受损状态。

在AD的发病机理中，主要病理变化为大脑皮层萎缩、Aβ沉积、神经原纤维缠结、大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑的形成[8]；而Aβ25-35是β淀粉样蛋白的主要毒性片段，其大量聚集和沉积导致老年斑的形成，这是AD形成的关键所在[9]。因此本实验采用Aβ25-35损伤海马神经元来考察rhCNTF对损伤细胞的作用。

AD患者的CNTF蛋白和mRNA水平有所降低[10]。在模拟海马神经元损伤的基础上，发现rhCNTF能够对抗A β引起的海马神经元损伤。rhCNTF对海马神经元有维持和促进生长的作用，这种作用与海马神经元的活动度呈指数相关；本实验中rhCNTF溶液的浓度已能使海马神经元的存活率达到最大。rhCNTF不仅能够改善已遭受Aβ损伤的海马神经元的生长状态和细胞活力，还能够预防对抗Aβ的损伤作用。另外，Aβ引起海马神经元的早期凋亡而rhCNTF可缓解这种凋亡效应。说明rhCNTF对抗Aβ损伤细胞的机制，是通过支持和营养神经元，提高细胞活力，以及减少细胞早期凋亡等途经发挥作用。这对前期关于rhCNTF通过降低过氧化水平而达到改善和缓解Aβ损伤作用的研究进行了补充[11]。本研究为CNTF用于预防和治疗AD疾病提供了理论依据。