慢性脊髓压迫减压后脊髓缺血再灌注损伤的动物实验研究

华 凯，郭庆升，张善勇

(辽宁省人民医院，沈阳110016)

颈椎病、颈椎管狭窄症、胸椎管狭窄症、椎管内肿瘤等都会造成脊髓的慢性压迫，进而导致脊髓功能严重受损，脊髓减压是治疗此类疾病最有效的方法。临床中常遇到手术后脊髓压迫症状短时间缓解后，随即出现症状加重现象，目前考虑此种现象为脊髓缺血再灌注损伤(SCIRI)，会造成脊髓毁灭性的神经功能受损［1～4］。鉴于 SCIRI对患者的损害严重，对其损伤机制的研究显得尤为重要。2011年5月～2012年5月，我们建立兔不同程度的颈髓压迫模型，减压后检测脊髓内再灌注损伤标志物及凋亡神经元，以明确再灌注损伤与脊髓压迫程度的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 新西兰白兔96只由吉林大学基础实验动物中心提供，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不限。饲养条件要求室温22℃，分笼饲养，自由进食。实验动物的处理方法均符合国家科学技术部颁发《关于善待实验动物的指导性意见》［5］。

1.2 方法

1.2.1 建立慢性脊髓压迫模型 经兔耳缘静脉采用戊巴比妥钠(25 mg/kg)麻醉，使其自由呼吸，切口局部及周围组织使用0.5%利多卡因注射局麻。经颈前方分离显露颈5椎体，先使用手钻在椎体上缓慢钻孔，钻透椎体后壁，然后在颈5椎体中央拧入一枚螺钉，透视显示螺钉进入椎管内20%左右时停止。术中监测未发现脊髓诱发电位有明显变化。冲洗术区后关闭创口。术后第1个月，每1周拧入螺钉0.25 mm。术后第2～4个月，每2周拧入0.25 mm。术后第5个月以后，每1个月拧入0.25 mm。

1.2.2 动物分组 96只动物随机分为A、B、C、D 4组，每组24只。A组:假手术组，颈5椎体上钻孔后即关闭创口，不拧入螺钉。B组:椎管螺钉占位达50%时停止拧入，继续饲养1个月。C组:椎管内螺钉占位达60%时停止拧入，继续饲养1个月。D组:椎管内螺钉占位达70%时停止拧入，并继续饲养1个月。根据脊髓组织取材时间不同以上每组又分为2 个亚组(A1、A2 组，B1、B2 组，C1、C2 组，D1、D2组)，每组12只。使用改良 Tarlov评分系统［6］对各组实验动物处死前评分，由一人单盲完成。

1.2.3 组织取材 A1、B1、C1、D1组动物均给予致死量的戊巴比妥钠(200 mg/kg)，迅速取出颈5椎体所对应的脊髓节段。将中央部分切除经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，剩余组织使用液氮转存于-80℃冰箱。A2、B2、C2、D2组耳缘静脉注射戊巴比妥钠(25 mg/kg)，自由呼吸，切口局部及周围组织使用0.5%利多卡因注射局麻。A2组仅显露颈5椎体后关闭创口。B2、C2、D2组显露并迅速取出螺钉，关创。6 h后所有动物给予致死量的戊巴比妥钠(200 mg/kg)，迅速取出颈5椎体所对应的脊髓节段，将中央部分切除经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋。剩余组织使用液氮转存于-80℃冰箱。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)及超氧化物激酶(SOD)活性测定 组织匀浆后采用超声细胞破碎仪破碎细胞，按1∶9配制成10%组织匀浆，匀浆介质为冰生理盐水。10 000 g离心15 min，取上清冻存于-80℃备测。SOD、GSH-px活性及MDA含量测定参照南京建成生物工程公司提供的测试和说明进行。

1.2.5 TUNEL凋亡染色 TUNEL试剂盒购自北京博奥深生物技术有限公司。石蜡切片厚度为4 μm，按说明书操作封片后荧光显微镜下观察，每只实验动物取3张切片，计算脊髓前角第Ⅷ、第Ⅸ板层TUNEL染色阳性神经元数目，由1名病理医师单盲观察，结果取3张切片计数的平均值。

1.2.6 统计学方法 采用 SPSS15.0统计软件，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，多组间两两比较采用SNK(Stundent-Newmall-Keuls)检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠处死前神经功能评分 Tarlov评分A1、B1、C1、D1 组分别为(4.00 ± 0.00)、(3.08 ±0.44)、(2.33 ± 0.61)、(1.58 ± 0.27)分，A2、B2、C2、D2组分别为(4.00 ± 0.00)、(3.66 ± 0.24)、(2.91 ±0.08)、(1.75 ±0.20)分。A 组 Tarlov评分显著高于B组、C组和D组(P均＜0.05)。B1、C1、D1组Tarlov评分依次减低，组间有统计学差异(P均＜0.05)。B2、C2组 Tarlov评分高于 B1、C1组，组间有统计学差异(P均＜0.05)。

2.2 各组大鼠脊髓组织中MDA含量及GSH-px、SOD活性 见表1。

表1 各组大鼠脊髓组织中MDA含量及SOD、GSH-px活性比较(±s)

表1 各组大鼠脊髓组织中MDA含量及SOD、GSH-px活性比较(±s)

注:与 A1组比较，aP ＜0.05;与 D1组比较，bP ＜0.01

组别 n M D A(n m o l/m g) S O D(U/m g) G S H-p x(U/m g)A 1组1 2 4.0 1 ±0.5 3 1 0 1.1 2 ±1 2.1 7 1 2.1 1 ±1.2 8 A 2 组 1 2 4.2 3 ±0.9 8 1 1 2.5 2 ± 9.8 2 1 3.5 2 ±2.0 1 B 1 组 1 2 5.4 3 ±0.3 7 a 9 0.3 5 ± 6.4 5 a 1 1.2 1 ±0.9 8 a B 2 组 1 2 5.6 9 ±1.0 8 8 8.2 9 ± 5.3 3 1 0.5 7 ±1.2 0 C 1 组 1 2 6.2 2 ±0.7 8 a 8 1.1 8 ± 4.3 8 a 9.4 8 ±0.8 7 a C 2 组 1 2 6.3 2 ±1.1 8 7 5.2 7 ± 5.5 7 8.9 3 ±0.7 1 D 1 组 1 2 6.5 1 ±0.5 6 a 7 8.4 5 ± 4.9 0 a 6.5 5 ±0.4 5 a D 2 组 1 2 8.9 1 ±1.5 2 b 6 1.2 3 ± 3.8 8 b 3.8 6 ±0.6 2 b

2.3 凋亡神经元计数 A1组、A2组未见TUNEL染色阳性神经元;与A1组相比，B1、C1、D1组阳性细胞数目逐渐增加，各组之间均有统计学差异(P均＜0.05)。A1 与 A2、B1 与 B2、C1 与 C2、D1 与 D2组比较无统计学差异(P均＞0.05)。见图1。

3 讨论

图1 各组TUNEL染色阳性神经元计数

脊髓受压后缺血缺氧，常导致脊髓神经细胞死亡或凋亡［7，8］。手术解除压迫是治疗脊髓压迫性疾病最直接也是最重要的方法。Nassr等［3］报道的连续750例多节段脊髓受压的颈椎病，减压手术后6.7%的患者出现了单个或多个神经根麻痹的现象，其中19%转变成永久性损害。脊髓长时间受到压迫，处于慢性缺血缺氧状态，而减压对于慢性受压脊髓是一种瞬时改变，减压术后即可见脊髓搏动，脊髓血液灌注相对于减压前迅速增加。目前认为脊柱减压手术后SCIRI是症状加重的主要原因。

本实验中通过建立脊髓慢性压迫模型发现，当螺钉在椎管内占位达到50%时出现轻微的行为学改变，随着螺钉的不断进入，实验动物的脊髓受压症状迅速加重。当椎管内占位达到60%以后，即使轻微的增加螺钉的进入即可明显地加重脊髓损伤症状，这与既往研究结果基本一致［9～11］。螺钉取出后，椎管内占位达50%和60%的实验动物神经功能明显恢复，而椎管内占位达70%的实验动物神经功能恢复不明显，其中1只动物出现螺钉取出后神经功能恶化的现象。这与临床上发现的脊髓减压后神经功能恶化发生于脊髓压迫严重的患者相一致［12］。

脊髓中脂质含量丰富，更易受到活性氧的攻击。压迫导致缺血使神经细胞线粒体氧化还原酶系脱耦联，产生大量氧自由基，后者易攻击脂质引发过氧化反应，MDA是脂质过氧化的最终产物，测定MDA可直接反映自由基水平，反映SCIRI的程度［13］。SOD除通过催化O-2歧化反应，发挥抗氧自由基外，还可增强H2O2浓度的调节功能保护组织细胞，能抵御自由基对细胞的破坏，保持细胞膜的完整性，SOD活性可反映机体对氧自由基清除能力的高低。GSH-Px能够减少氧化反应中羟基产生，是脊髓组织中清除过氧化物的重要酶类。本研究中，脊髓组织中MDA含量随着脊髓压迫程度的增加而增加。说明随着脊髓压迫程度的增加，产生脊髓循环障碍，微血管栓塞，神经元线粒体功能障碍，线粒体氧化还原酶系脱耦联，产生过多氧自由基，后者易攻击脂质引发过氧化反应。当解除螺钉压迫后，MDA含量较之前有不同程度的提高，且提高程度与压迫水平呈正相关。当螺钉在椎管内占位达到椎管径线的70%时，减压后脊髓中MDA增高显著，与减压前比较有统计学差异。反映减压后脊髓供血供氧突然增加，通过多种途径使氧自由基迅速增加，使脂质过氧化，MDA产生过多。MDA在各组中的变化说明了慢性脊髓压迫减压后SCIRI的存在，而且其损伤程度随压迫程度增加而增加。

本实验中凋亡神经元随脊髓压迫程度加重而增多，而减压前和减压后比较，凋亡神经元数量无差异，考虑可能与减压后观察时间过短有关。

［1］Rovira M，Torrent O，Ruscalleda J.Some aspects of the spinal cord circulation in cervical myelopathy［J］.Neuroradiology，1975，9(4):209-214.

［2］Chiba K，Toyama Y，Matsumoto M，et al.Segmental motor paralysis after expansive open-door laminoplasty［J］.Spine，2002，27(19):2108-2115.

［3］Nassr A，Eck JC，Ponnappan RK，et al.The incidence of C5palsy after multilevel cervical decompression procedures:a review of 750 consecutive cases［J］.Spine，2012，37(3):174-178.

［4］Fehlings MG，Tator CH.The relationships among the severity of spinal cord injury，residual neurological function，axon counts，and counts of retrogradely labeled neurons after experimental spinal cord injury［J］.Exp Neurol，1995，132(2):220-228.

［5］Mackey ME，Wu Y，Hu R，et al.Cell death suggestive of apoptosis after spinal cord ischemia in rabbits［J］.Stroke，1997，28(10):2012-2017.

［6］Liu XZ，Xu XM，Hu R，et al.Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury［J］.J Neurosci，1997，17(14):5395-5406.

［7］Shinomiya K，Mutoh N，Furuya K，et al.Study of experimental cervical spondylotic myelopathy［J］.Spine，1992，17(10):S383-387.

［8］ Schramm J.A model for chronic spinal cord compression in cats［J］.Neurochirurgia(Stuttg)，1982，25(4):113-115.

［9］Kong KM，Qi WL，Zhong Q，et al.Experimental study of apoptosis in chronic compressive injury of the spinal cord［J］.Chin Jour Trau，2001，17(3):158-160.

［10］Basu S，Hellberg A，Ulus AT，et al.Biomarkers of free radical injury during spinal cord ischemia［J］.FEBS Letters，2001，508(1):36-38.

［11］Hall ED.Inhibition of lipid peroxidation in CNS trauma［J］.J Neurotrauma，1991，8(7):31-40.

［12］Lang-Lazdun L，Heurteaux C，Mignon A，et al.Ischemic spinal cord injury induced by aortic cross-clam ping:prevention by riluzole［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2000，18(2):174-181.

［13］Pointillart V，Petitjean ME，Wiart L，et al.Pharmacological therapy of spinal cord injury during the acute phase［J］.Spinal Cord，2000，38(2):71-76.