金诃子低温提取物的免疫活性

赵小霞，邱丽君，宣成睿，罗 夏，孙 鹏，杨丽敏

(1天津市第四中心医院，天津300140;2内蒙古医科大学)

诃子又名诃黎勒、诃黎、诃梨、随风子等，为君子科植物诃子及其变种绒毛诃子干燥的成熟果实，其味涩性平，可祛三弊所引起的诸疾，有解毒之功效;而金诃子是蒙药诃子当中的最佳品种，色显金黄，故名为金诃子［1，2］。现代药理研究发现，诃子由多种糖类、氨基酸、维生素类和大量的鞣质等组成，有调节免疫、抗氧化、抗菌、抗糖尿病、保护肝脏、抗炎、抗癌变、抗增殖、抗辐射、保护心脏、抗关节炎、抗过敏、保护胃肠动力和治愈伤口等作用［3～5］。2012年 1 月～2013 年 2月，本研究探讨了金诃子低温提取物对小鼠固有免疫和适应性免疫的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 动物:18～22 g昆明鼠，雌雄各半，购自内蒙古大学动物室;健康雄鸡购于市场。试剂:金诃子购于内蒙古呼和浩特市中蒙医院;吉姆萨—瑞特染色液购于北京诺博莱德科技有限公司。仪器:GZX-9070MBE电热恒温鼓风干燥箱购于上海博讯公司;LGJ-18冷冻干燥机购于北京松原兴华公司;DZG-303A离子纯水机购于美国摩尔公司;YDL5M离心机购于湘仪离心机厂。

1.2 方法

1.2.1 金诃子不同部位提取物的提取及其成分测定 取金诃子1 000 g，粉碎后取990 g加入5 000 mL的超纯水，浸泡5 h，放入-25℃的冰箱冷冻，过夜。将冷冻后的金诃子解冻，4 000 r/min、离心40 min，去渣，留上清液，上述方法重复两次，将两次的上清液混合，用不同的分离方法及透析膜分离等技术分离出5个有效部位，将不同部位的提取液冷冻干燥。具体提取工艺正在专利申请中。将不同部位的提取物在清华大学分析中心采用红外光谱技术进行成分和含量测定。

1.2.2 分组及给药方式 取昆明鼠170只，随机分为阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(灵芝多糖)及金诃子不同部位提取物高、中、低剂量组，共17组，每组10只。每天给小鼠灌胃1次，阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予灵芝多糖1.5 mg/(kg·d)，高、中、低剂量组分别给予 25、2.5、0.25 mg/(kg·d)金诃子，连续灌胃给药14 d。

1.2.3 体内淋巴细胞转化实验 14 d给药结束后，第2天晨起通过取小鼠尾部末梢血制片，晾干，吉姆萨—瑞特染色，100倍油镜下计数200个淋巴细胞，计算其中的淋巴母细胞数和过渡型母细胞所占的百分率，即为淋巴细胞转化率。

1.2.4 腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 于末次给药7 h后，每只小鼠腹腔注射2%淀粉1 mL。取抗凝的鸡血10 mL，加入50 mL生理盐水，离心洗涤3次，1 000 r/min离心5 min，末次1 000 r/min离心10 min，弃上清，制成压积血。吸压积血2 mL加入198 mL生理盐水中混匀，制备1%鸡红细胞悬液。第2日晨起每只小鼠腹腔注射1%鸡红细胞悬液0.5 mL，轻揉腹部，30 min后脱颈椎处死小鼠，立即剖开腹腔，加入3 mL无钙镁的Hangk’s液，轻揉1 min，用移液器吸取腹腔液约2.5 mL，放到离心管中500 r/min离心3 min;倒掉上清液，吸取200 μL滴加在玻片上，涂抹均匀，自然干燥。吉姆萨—瑞特染色，40倍或100倍镜下观察，计算吞噬百分率，吞噬百分率=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞)×100%。

1.2.5 统计学方法 采用 SPSS10.0软件，数据用±s表示，各项指标组间比较采用t检验。P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 金诃子不同部位提取物的回收率和物理性状采用低温提取和冷冻干燥的方法从金诃子中提取不同部位的成分，最终得到金诃子5个不同部位提取物干粉:分别命名为1号部位、2号部位、3号部位、4号部位、5号部位。990 g的生药可以提取出(499.8±15.9)g提取物，回收总得率约 50%，其中5个不同部位的回收数量分别为:1号部位:(129.1±3.3)g、2 号部位:(148.3 ± 5.1)g、3 号部位:(127.7 ±4.3)g、4 号部位:(73.5 ± 3.2)g、5 号部位:(21.2±0.5)g。不同部位成分可完全溶解于水，呈不同色泽和味觉感受。5个提取部位分别采用红外光谱技术测定含量，结果见图1～5。

图1 金诃子1号部位提取物红外光谱图

图2 金诃子2号部位提取物红外光谱图

图3 金诃子3号部位提取物红外光谱图

图4 金诃子4号部位提取物红外光谱图

图5 金诃子5号部位提取物红外光谱图

2.2 金诃子不同部位提取物对小鼠淋巴细胞转化能力的影响 淋巴母细胞数和过渡型母细胞的形态学改变为细胞体积明显增大，为成熟淋巴细胞的3～4倍。核膜清晰，核染色质疏松呈网状。核内见明显核仁1～4个。胞质丰富，嗜碱性，有伪足样突出。胞质内有时可见小空泡。淋巴细胞转化率阴性对照组(21.20±3.58)%，阳性对照组(29.40±3.57)%，1号部位低、中、高剂量组分别为(30.10±3.03)%、(36.11 ± 5.09)%、(33.21 ± 2.57)%，2号部位低、中、高剂量组分别为(29.10±6.04)%、(35.25 ±4.02)%、(32.31 ±3.77)%，3 号部位低、中、高剂量组分别为(33.45 ±6.75)%、(34.71 ±4.14)%、(32.67 ±5.77)%，4 号部位低、中、高剂量组分别为(29.93 ±5.12)%、(36.34 ±4.89)%、(30.11 ±3.75)%，5 号部位低、中、高剂量组分别为(37.32 ± 4.25)%、(38.40 ± 5.21)%、(36.23 ±3.78)%。金诃子不同部位不同剂量组淋巴细胞转化率均高于阳性及阴性对照组(P均＜0.01)。

2.3 金诃子不同部位提取物对巨噬细胞吞噬功能的影响 巨噬细胞吞噬百分率阴性对照组为(19.70±2.68)%，阳性对照组为(27.40 ±3.56)%，1 号部位低、中、高剂量组分别为(33.20 ±6.60)%、(39.23 ±5.32)%、(31.43 ±5.50)%，2 号部位低、中、高剂量组分别为(34.35 ±6.09)%、(39.60 ±7.15)%、(34.38 ±4.67)%，3号部位低、中、高剂量组分别为(31.72±3.99)%、(36.51 ±8.45)%、(33.37 ±6.56)%，4 号部位低、中、高剂量组分别为(31.42 ±4.57)%、(34.32 ±6.57)%、(29.90 ±4.53)%，5 号部位低、中、高剂量组分别为(37.84 ±5.56)%、(41.37 ±4.88)%、(36.53 ±3.56)%。不同部位不同剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率均高于阳性对照组及阴性对照组(P均＜0.01)。

3 讨论

中药是一个极其复杂的混合物体系，药材质量控制采用中药的化学指纹图谱，该指纹图谱可以反映药材所含的全部化学成分或者大多数成分的情况，代表了这个中药的综合化学特征。目前红外光谱因其专属性强、重现性好、操作方便等优势已成为中药研究化学图谱不可缺少的工具，红外光谱法在中草药及中成药有效成分的含量测定中具有独特作用［6，7］。本研究采用红外光谱技术对其成分进行分析，5个部位图形相似，各种成分均有，只是含量高低不同。我们猜测正是因为不同成分的含量差别，所以5个部位在低温时表现出不同的物理性状、不同的色泽和味觉感。5个部位具体的药效是否会有不同有待进一步研究。文献报道，诃子水提物可提高人体的抗体滴度［4］，诃子的粗提物可增强阿米巴肝脓肿仓鼠的细胞免疫应答［5］，1 mg/mL诃子常规熬制成的汤剂可增强小鼠非特异性免疫能力［5］，但文献中使用的是诃子的熬制汤剂，汤剂的浸泡时间、熬制时间、汤剂中的药物成分在文献中均未见报道。而本研究采用低温提取，优化了提取工艺，将成分和含量进行了红外光谱法的标准化检测，进一步探讨其在固有免疫和适应性免疫方面的作用。通过经典的体内淋巴细胞转化试验证实，5个部位的金诃子成分均可增强小鼠淋巴细胞功能，且通过经典的腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验证实5个部位均可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，不同部位之间对于小鼠淋巴细胞转化率和巨噬细胞吞噬百分率差异无统计学意义，提示不同部位之间含量的差别对于免疫增强作用无影响。

总之，本研究提取了金诃子5个部位不同物理性状、色泽和味觉的成分，并证实其均可增强小鼠的固有免疫和适应性免疫。未来的研究将进一步探讨5个不同部位成分的抗菌、抗肿瘤、抗病毒等作用，并观察它们之间的差别，从而为中药的有效利用、减轻不良反应以及成分和药效之间、成分含量和药效之间的关系探索提供理论基础和实验依据。

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