人破骨细胞的体外分离培养及与骨髓瘤细胞的相互作用

张建华 董春霞 任方刚 覃艳红 杨林花

(山西医科大学第二医院血液科，太原030001)

骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞促进骨髓微环境中破骨细胞前体(osteoclast precursor cell，pOC)向破骨细胞(osteoclasts，OC)分化，介导溶骨性骨重吸收，骨质溶解及骨重吸收导致细胞外基质释放多种细胞因子促进MM细胞生长，从而在骨质破坏及肿瘤进展中形成恶性循环。研究［1-3］表明，阻断溶骨途径可以发挥抗骨髓瘤效应。本实验旨在探讨正常人破骨细胞体外分离培养的可行性及与MM细胞之间的相互作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株

8226细胞引自美国组织细胞库。

1.2 试剂和仪器

RPMI-1640、α-MEM培养基为美国Gibco公司产品;新生牛血清购自杭州四季青生物材料研究所;核因子κB受体激活剂-Fc段(receptor activator of nuclear factor kappa-B Fc，RANKL)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colone-stimulating factor，M-CSF)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)为美国Cytolab公司产品，碘化丙啶、二甲亚砜、耐酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)试剂盒均为美国Sigma公司产品;淋巴细胞分离液(Ficoll)为上海化学试剂三厂产品;Annexin-V凋亡试剂盒购自澳大利亚Bender MedSystems公司;地塞米松为上海通用制药公司产品;Transwell培养板购自美国Costar公司;培养箱购自德国Heraeus公司;倒置显微镜日本Olympus公司;低温冰箱购自美国Legaci公司。

1.3 定型的破骨细胞前体及破骨细胞的准备

白细胞为红十字中心血站提供，采自健康成年男性。将20 mL白细胞用无钙镁PBS缓冲液3倍稀释后，沿管壁缓缓加入盛有Ficoll液的离心管中，使其悬于分离液上方，室温下2 000 r/min离心30 min后收集混浊带分离获得的细胞，用无钙镁PBS洗3次，后用含10%小牛血清、50 ng/mL RANKL、25 ng/mL M-CSF 及10 nmol/L 地塞米松的α-MEM培养基(OC培养基)调整细胞至2.5×106/mL，接种于25 mL培养瓶，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱，培养2～4 d后用新鲜培养基洗3次去除悬浮细胞，贴壁细胞为单个核，TRAP+细胞，认为是定型的破骨细胞前体细胞。继续加入OC培养基培养6～10 d后即可形成大量多个核的破骨细胞。

1.4 pOC的迁移实验

趋化实验采用24孔Transwell培养板，孔径为5 μm。按millipore transwell操作说明进行，上室为每300 μL pOC(1×105)悬液(OC条件培养基培养后)，下室为700 μL条件培养基(1×106/mL 8266细胞培养后)或新鲜培养基，培养3 h后去transwell insert，TRAP染色，计算2组细胞的迁移率。

1.5 pOC的分化实验

新鲜分离的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)或定型的 pOC(1×106/mL)与5×105/mL的8226细胞在含10%小牛血清、25 ng/mL M-CSF的α-MEM培养基(无RANKL)共培养7～14 d后行TRAP染色，实验分为2组:A组为PBMCs+8226细胞;B组为pOC+8226细胞。

1.6 PBMC-OC与MM细胞的共培养实验

收集上述培养的PBMC-OC，按每孔2.4×104个接种于24孔板，加入M-CSF及RANKL继续培养24 h贴壁。细胞增生实验组加入每孔1×105个8226细胞，单独或共培养3 d、7 d后分别观察计数。细胞周期实验组每孔加入2×105个8226细胞，同时设非直接接触组(Transwell组)，单独或共培养48 h后收集细胞，PBS洗2次，采用PI染色流式细胞术检测。细胞凋亡实验组加入每孔2×105个8226细胞，分为2组:去血清培养组用1%α-MEM培养基;地塞米松(Dex)组加入2×10-7μmol/mL Dex，单独或共培养48 h后收集细胞，PBS洗2次，Annexin-V/PI标记，流式细胞术检测。

1.7 OC对MM细胞的吞噬实验

8226细胞经10-6mol/L Dex培养5 d后诱导细胞死亡，台盼蓝(用PBS按1:1稀释)染色10 min后PBS洗3次，重悬于OC培养基，加至每孔含1×105个OC的24孔培养板，培养4～24 h后显微镜观察。

1.8 统计学方法

用SPSS10.0进行统计学分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC-OC的生长特性

pOC及成熟的多个核的OC来源于健康成人的PBMCs，pOC经OC培养基培养4 d后弃去悬浮细胞，贴壁细胞大部分为髓系单个核细胞，其中95%表达TRAP，pOC经OC培养基继续培养6～10 d后，可见单个核细胞逐渐成梭形，融合形成多个核的TRAP+细胞。

2.2 MM细胞条件培养基诱导pOC迁移

采用24孔Transwell培养板行pOC趋化实验显示，8226细胞(1×106/mL)培养后的条件培养基可诱导pOC明显迁移，而新鲜培养基组仅见很少部分细胞迁移，两组细胞的迁移率分别为(28.36±0.08)%、(1.53±0.06)%，(P ＜0.01，图1)。

图1 骨髓瘤细胞条件培养诱导pOC迁移Fig.1 Multiple myeloma cell conditioned medium induced pOC migration.

2.3 MM细胞诱导pOC向OC分化

在无RANKL的培养环境中，定型的pOC与8226细胞共培养7～14 d后可见多个核的TRAP+细胞形成，而PBMCs与8226细胞共培养组细胞逐渐崩解死亡，未见OC生成(图2A、2B)。

图2 骨髓瘤细胞条件培养基诱导pOC迁移Fig.2 Multiple myeloma cells actively attracted pOCs and induced OCs formation(200×)

2.4 PBMC-OC促进MM细胞增生

8266细胞与PBMC-OC单独或共培养3 d、7 d后计数显示，与OC共培养后增生更明显，细胞数分别为:对照组 (2.1±0.11)×105和(3.9±0.09)×105，共培养组(4.0±0.15)×105和(9.0±0.14)×105(P＜0.01，图3)。流式细胞术检测细胞周期显示，8226与PBMC-OC直接接触或非直接接触培养后，G0/G1期细胞比例减少，而S期细胞比例增多。

图3 PBMC-OC促进骨髓瘤细胞增生Fig.3 PBMC-OC stimulate the proliferation of multiple myeloma cells

2.5 MM细胞促进OC存活

在无M-CSF及RANKL条件下，OC与MM细胞共培养7 d后，几乎所有OC仍可存活;相反，OC单独培养组细胞数量逐渐减少、破碎细胞增多。

2.6 PBMC-OC可抑制去血清培养诱导的MM细胞的死亡

8226细胞用1%α-MEM培养基培养48 h后Annexin-V-及PI-细胞(存活细胞)减少至(26.24±0.11)%，与OC共培养后 Annexin-V-及PI-细胞为(90.92±0.15)%(P ＜0.01，图4)。

图4 PBMC-OC抑制去血清培养诱导的骨髓瘤细胞的死亡Fig.4 PBMC-OCs rescued multiple myeloma cells from death in serum-depleted cultures

2.7 PBMC-OC对地塞米松诱导的MM细胞的死亡无拮抗作用

8226细胞经2×10-7μmol/mL Dex培养48 h后41.36%细胞死亡，与OC共培养后死亡细胞数无明显减少，为30.71%(P＞0.05)。

2.8 OC吞噬死亡的MM细胞

OC可通过吞噬作用清除死亡的8226细胞，从而促进细胞生长与存活(图5)。

图5 OC吞噬死亡的8226细胞Fig.5 Osteoclasts phagocytic 8226 cell death(200 × )OC:osteoclasts.

3 讨论

MM骨病以MM细胞浸润部位成骨细胞减少为特征，提示肿瘤细胞可能通过产生关键的OC生成因子直接增强OC活性。临床实验及MM动物模型研究显示［1-3］，OC 抑制剂，包括双磷酸盐、RANK-Fc及骨保护蛋白(osteoprotegerin，OPG)，不仅阻断MM介导的骨质破坏，而且发挥抗骨髓瘤效应阻止肿瘤进展。这些发现提示OC与MM细胞之间的相互作用可能对骨髓瘤细胞在骨髓中扩增发挥重要作用。然而由于OC体外分离培养的困难，这一作用以及相关机制的研究涉及甚少。

本实验参照 Sabokbar等［4］及 Yaccoby 等［5］的体外OC培养方法，利用采自健康成年男性的白细胞分离出单个核细胞，在完全OC培养基中培养4 d后可见大部分髓系单个核细胞为TRAP+细胞，即定型的pOC。pOC与8226细胞共培养后发现，在无基质细胞的培养条件下，MM细胞可招募定型的pOC，直接促进其向成熟的OC分化，而MM细胞并不促进未定型的祖细胞向OC分化，提示定型的pOC可能上调MM细胞对RANKL的表达，在骨髓微环境中其他细胞或细胞因子把髓系单个核祖细胞定型为破骨细胞系。这与Yaccoby等［5］利用原代 MM浆细胞与采自 MM患者外周血分离培养的OC共培养结果一致，他们推测MM患者骨中除成骨细胞减少外，血管内皮细胞增多可能也参与上述过程。血管内皮细胞可以产生趋化因子对单个核细胞具有趋化作用，表达OC生成的关键因子如M-CSF、RANKL及OPG，还可以直接诱导活化的多个核OC生成。Okada等［6］研究证实，B9/BM1鼠MM细胞通过CD44上调骨髓内皮细胞表达RANKL，进而通过直接接触作用促进pOC向OC分化并迁移至骨髓。

在上述培养体系中，pOC经完全OC培养基继续培养6～10 d后，可见单个核细胞逐渐成梭形、融合形成多个核的TRAP+细胞，即为破骨细胞。随后本课题组将OC与MM细胞(8226细胞)共培养后行显微镜观察计数、PI染色检测细胞增生周期及Annexin-V/PI标记检测存活细胞比例显示，在无 M-CSF及RANKL条件下，MM细胞仍可促进OC存活;OC明显非IL-6细胞系增生，抑制去血清培养诱导的MM细胞死亡，直接或间接共培养组OC均可促进MM细胞进入S期，提示MM细胞与OC之间的相互作用是双向的。这与Abe等［7］研究结果一致，健康人群及MM患者自身PBMC-OC均可促进MM细胞存活，且作用强于骨髓基质细胞。他们的研究结果还显示，OC可以拮抗阿霉素诱导的MM细胞的死亡，OC与MM细胞共培养后IL-6及骨桥蛋白(osteopontin，OPN)分泌增多，阻断细胞之间的相互作用后IL-6质量浓度明显下降，但MM细胞增生与IL-6质量浓度增加并无明显相关。本课题组研究结果显示，OC对地塞米松诱导的MM细胞死亡并无拮抗作用。结合Abe等［7］研究结果提示MM骨病患者可能对阿霉素产生耐药，而地塞米松对MM骨病患者的MM细胞仍具有杀伤作用。本课题组将8226细胞诱导死亡与OC共培养24 h后通过显微镜观察发现，OC可以吞噬死亡的MM细胞，Yaccoby等［5］研究结果也显示OC可通过吞噬作用清除凋亡及死亡的MM细胞，而不影响MM细胞的活力及生长存活的能力。上述结果提示OC可能通过直接接触作用或与某些细胞因子的分泌共同作用，以及对MM细胞的吞噬作用促进MM细胞增生与存活。

Zavrski等［8］体外实验发现，蛋白酶体抑制剂(MG-132、MG-262)通过抑制破骨细胞中蛋白酶体-泛素系统阻断RANKL介导的OC生成及其生物学活性。在以硼替佐米为主方案治疗合并骨病的MM患者临床研究中也显示［9-11］，除优越的疾病缓解率外，骨痛缓解率及骨质修复亦明显高于其他方案，其中不乏更多的节点因子参与。本课题组已经完成的破骨细胞在多发性骨髓瘤发病中的作用这一研究结果也显示［12］，RANKL/OPG在二者相互作用中发挥重要作用。为体外培养破骨细胞的可行性及简便性进一步研究其与骨髓瘤细胞相互作用中的节点因子提供了可靠的平台，RANKL/OPG在这一相互作用中的重要性及其对MM分期及骨病早期评价中的地位有待进一步研究证实［13］。

［1］ Yaccoby S，Pearse R N，Johnson C L，et al.Myeloma interacts with the bone marrow microenvironment to induce osteoclastogenesis and is dependent on osteoclast activity［J］.Br J Haematol，2002，116(2):278-290.

［2］ Vanderkerken K，De Leenheer E，Shipman C，et al.Recombinant osteoprotegerin decreases tumor burden and increases survival in a murine model of multiple myeloma［J］.Cancer Res，2003，63(2):287-289.

［3］ Croucher P I，Shipman C M，Lippitt J，et al.Osteoprotegerin inhibits the development of osteolytic bone disease in multiple myeloma［J］.Blood，2001，98(13):3534-3540.

［4］ Sabokbar A，Athanasou N S.Generating human osteoclasts from peripheral blood［J］.Methods Mol Med，2003，80:101-111.

［5］ Yaccoby S，Wezeman M J，Henderson A，et al.Cancer and the microenvironment:myeloma-osteoclast interactions as a model［J］.Cancer Res，2004;64(6):2016-2023.

［6］ Okada T，Akikusa S，Okuno H，et al.Bone marrow metastatic myeloma cells promote osteoclastogenesis through RANKL on endothelial cells［J］.Clin Exp Metastasis，2003，20(7):639-646.

［7］ Abe M，Hiura K，Wilde J，et al.Osteoclasts enhance myeloma cell growth and survival via cell-cell contact:a vicious cycle between bone destruction and myeloma expansion［J］.Blood，2004，104(8):2484-2491.

［8］ Zavrski I，Krebbel H，Wildemann B，et al.Proteasome inhibitors abrogate osteoclast differentiation and osteoclast function［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，333(1):200-205.

［9］ Schmiedel B J，Scheible C A，Nuebling T，et al.RANKL expression，function，and therapeutic targeting in multiple myeloma and chronic lymphocytic leukemia［J］.Cancer Res，2013，73(2):683-694.

［10］ Schulze M，Weisel K，Grandjean C，et al.Increasing bone sclerosis during bortezomib therapy in multiple myeloma patients:results of a reduced-dose whole-body MDCT study［J］.AJR Am J Roentgenol，2014，202(1):170-179.

［11］Mohty M，Malard F，Mohty B，et al.The effects of bortezomib on bone disease in patients with multiple myeloma［J］.Cancer，2014，120(5):618-623.

［12］张建华，傅晋翔，张晓慧，等.破骨细胞在多发性骨髓瘤发病中的作用［J］.中华血液学杂志，2007，28(5):323-326.

［13］肖静，丛琳，张文娟，李召，等.多发性骨髓瘤治疗前后血清NTX-Ⅰ和BALP及OPG变化临床意义分析［J］.中华肿瘤防治杂志，2012，19(14):1112-1114.